Fsp27基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

发布时间：2022-02-21 22:23

　　构建脂肪特异性蛋白27（Fat-specific protein of 27,Fsp27）基因沉默载体,研究沉默Fsp27基因表达对3T3-L1细胞脂解的影响,并对其作用机制进行探究。采用RNAi技术,构建Fsp27基因真核干扰载体,下调Fsp27基因的表达。"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。脂质体转染脂肪细胞,油红O染色脂滴,酶法测定细胞中甘油及甘油三酯的含量。Western blot法检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ的蛋白表达。Western blot结果显示:阳性sh-Fsp27干扰载体均能有效下调Fsp27的表达,且伴随细胞内ATGL和PPARγ的表达量升高（P<0.05）,其中sh-Fsp27-2的沉默效果最好;酶学方法检测结果显示:阳性sh-Fsp27干扰组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高（P<0.05）;油红O染色结果发现:空白对照组与阴性对照组均有大脂滴堆积,阳性sh-Fsp27组小脂滴分布广泛,未见明显的大脂滴。sh-Fsp27-2组基因沉默载体的沉默效果最好,Fsp27基因沉默可以加快3T3-L1细胞的脂解速... 

【文章来源】：生物技术通报. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

sh-Fsp27质粒序列鉴定

细胞脂质体转染4 d后，荧光显微镜下观察拍照显示：4组红色荧光蛋白基本表达一致，转染效率在45%左右（图2-A），阴性对照组和阳性sh-Fsp27干扰载体之间的转染效果没有显着差异。Western blot结果显示，与sh-Fsp27-0组和空白组比较，3个阳性干扰载体可以明显下调Fsp27蛋白的表达量（P<0.05）（图2-B），且在3个阳性载体中sh-Fsp27-2干扰载体下调Fsp27蛋白表达的效果最好，后续实验以sh-Fsp27-2作为阳性组。2.4 脂肪细胞中脂滴的变化

未分化的3T3-L1前脂肪细胞呈纤维样，胞质内无明显脂滴。诱导分化后，细胞形态由成纤维样变为圆形，伴随着胞体的增大，胞内出现脂滴。油红O将细胞中的脂质染成红色，普通光学显微镜下观察可见，对照组与sh-Fsp27-0组脂滴生成较快，8 d时能明显观察到脂滴聚集，12 d可见小脂滴融合成大脂滴；阳性sh-Fsp27组均可见大量小脂滴广泛地分布于细胞核周围，且在12 d时仍未出现明显的大脂滴（图3）。2.5 脂肪细胞内TG和甘油含量

【参考文献】：
期刊论文
[1]脂滴与线粒体相互作用的研究进展[J]. 蒲静,张雪琳,刘平生.  生物物理学报. 2012(02)
[2]一种调控脂解的重要蛋白——围脂滴蛋白（Perilipin）[J]. 张利红,张立杰,杨公社.  中国生物化学与分子生物学报. 2006(12)



本文编号：3638147