人感染高致病性H7N9禽流感病毒耐药研究

发布时间：2022-04-27 19:54

　　人感染高致病性 H7N9 禽流感（Highly pathogenic avian influenza H7N9,HPAIH7N9）病毒病例首次出现于2016年底的H7N9第五波疫情中,之后于2019年春再次出现。作为2013年出现的新型H7N9病毒的变异体,HPAI H7N9病毒的主要特征是其血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白裂解位点上出现多碱性氨基酸的插入,从而使H7N9病毒由低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza,LPAI）病毒转变为高致病性禽流感病毒。虽然人感染HPAI H7N9病例的死亡率与LPAI H7N9（“低致病”指对禽类而言）相似,但似乎前者的病情发展更快、临床症状更严重。截止到2020年4年27日,HPAIH7N9病毒已造成33例实验室确诊病例,其中16例死亡。神经氨酸酶抑制剂（Neuraminidase inhibitors,NAIs）类药物是临床治疗H7N9禽流感病例的主要手段,但由于流感病毒易突变的特点,需对病毒的耐药性进行实时监测。本研究首次系统全面地对人感染HPAI H7N9病毒病例分离株进行NAIs耐药性研... 

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

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英文缩略词表
摘要
ABSTRACT
一.前言
    1.人感染高致病性H7N9禽流感病毒
    2.神经氨酸酶抑制剂及耐药位点
二.材料与方法
    1.病毒
        1.1 野生型HPAI H7N9病毒
        1.2 HPAI H7N9重组病毒的制备
        1.3 H7N9/PR8重组病毒的制备
    2.细胞
        2.1 MDCK细胞的培养
        2.2 293T细胞的培养
    3.病毒测序及分析
        3.1 Sanger测序
        3.2 二代测序
        3.3 突变位点混合氨基酸比例分析
    4.流感病毒NA活性及其活性抑制的测定方法
    5.潜在NAIs耐药突变位点的筛选
    6.病毒滴定(TCID_(50))及生长曲线
        6.1 病毒滴定
        6.2 生长曲线
    7.NAIs诱导HPAI H7N9病毒氨基酸突变
    8.HA、NA蛋白上氨基酸突变位点标记及展示
    9.小鼠实验
        9.1 麻醉及感染
        9.2 解剖及取材
        9.3 小鼠灌胃给药
        9.4 组织研磨及病毒载量测定
        9.5 血凝试验和血凝抑制试验
        9.6 病理学实验
    10.统计学分析
    11.生物安全
    12.主要试剂耗材及实验仪器设备
三.结果
    第一部分 HPAI H7N9病毒药物敏感性及耐药位点的鉴定
        1.HPAI H7N9野毒株耐药表型鉴定
        2.HPAI H7N9野毒株潜在耐药突变位点的筛选
        3.重组HPAI H7N9病毒制备成功
        4.HPAI H7N9病毒耐药位点的鉴定
        5.HPAI H7N9耐药株在哺乳动物细胞上的生长情况
        6.NA耐药位点在N9晶体结构中的展示
        7.HA上多碱性氨基酸对HPAIH7N9耐药株复制的影响
    第二部分 HPAIH7N9重组病毒在NAIs作用下出现适应性突变
        1.内部基因未出现氨基酸突变
        2.NA蛋白上出现R292K、E119V/G氨基酸突变
        3.HA蛋白上出现多个氨基酸突变
        4.HA蛋白的氨基酸突变聚集在HA1区域
    第三部分 N9 1222L- E119V双位点突变的协同耐药作用
        1.HPAI H7N9病毒NAI222L突变对E119V位点有协同耐药作用(体外)
        2.NA222L-119V双位点突变HPAIH7N9病毒在MDCK细胞上复制良好
        3.H7N9/PR8重组病毒制备成功
        4.rg006NA/PR8、rg006NA119V/PR8、rg006NA222L-119V/PR8病毒对小鼠的致病性
            4.1 体重减轻及致死率
            4.2 在小鼠呼吸道中复制水平
            4.3 对小鼠的感染能力
            4.4 肺炎情况及抗原分布
        5.rg006NA/PR8、 rg006NA119V/PR8、 rg006NA222L-119V/PR8病毒在小鼠上的耐药性
            5.1 体重损失及死亡率
            5.2 肺病毒载量
            5.3 肺炎情况及抗原分布
四.讨论
五.结论
六.参考文献
七.综述 Research Progress on Human Infection with Avian Influenza H7N9 Virus
    参考文献
八.致谢
九.博士生期间科研成果
十.个人简历



本文编号：3649074