黑曲霉CRISPR基因组编辑技术建立与内质网磷脂调控机制的研究
发布时间：2022-06-02 20:33
黑曲霉被广泛应用于商用蛋白的生产,但是针对黑曲霉的遗传操作工具却比较单一化。传统的同源重组系统有着操作简便、适用范围广的特点,但是其效率普遍偏低,因此一套操作简便而且效率高的遗传操作工具亟待开发。黑曲霉具有强大的胞外蛋白分泌能力,但是异源蛋白在黑曲霉中的分泌表达能力却不尽人意。对其限制因素的分析表明,异源蛋白基因的转录以及m RNA稳定性水平总体上是令人满意的,其生产瓶颈主要存在于内质网中蛋白翻译后分泌途径中的修饰过程。磷脂作为内质网的主要成分,对内质网的形态、体积、功能有重要的影响。酿酒酵母中报道过主要调控磷脂代谢的转录因子ino2/ino4除了对磷脂代谢调控有主导作用,进而影响内质网的功能,也会影响内质网蛋白加工稳态环境。然而在黑曲霉中,关于磷脂代谢的转录调控研究得却是少之又少。内质网磷脂稳态失衡会造成脂质双层成分的扰动,进而影响内质网的形态,这种变化可以独立于UPR压力而激活内质网的UPR效应。同时,蛋白分泌途径中UPR信号机制除了作为内质网压力的应答途径,促进控制胞内蛋白质量控制与动态平衡外,UPR调控基因中也包含许多与磷脂代谢相关的功能基因。内质网的蛋白稳态与磷脂代谢稳态有某...
【文章页数】：198 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 黑曲霉基因编辑系统
1.1.1 黑曲霉基因编辑系统发展概述
1.1.2 丝状真菌中CRISPR/Cas9 系统的应用现状
1.1.3 黑曲霉中CRISPR系统目前所面临的一些问题
1.2 黑曲霉蛋白合成分泌与内质网UPR机制的关系
1.2.1 黑曲霉蛋白分泌途径概述
1.2.2 丝状真菌内质网的UPR效应机制
1.2.3 内质网UPR机制在丝状真菌蛋白生产中的应用
1.3 真菌内质网UPR效应与膜结构相互影响
1.3.1 真菌内质网结构概述
1.3.2 内质网脂质的扰动可以激活内质网UPR效应
1.3.3 真菌磷脂相关代谢物的扰动可以激活UPR效应
1.4 真菌磷脂合成机制
1.4.1 真菌磷脂合成途径
1.4.2 真菌磷脂合成的遗传调控
1.4.3 肌醇对于真核微生物磷脂合成的调控
1.4.4 磷脂代谢调控与内质网压力诱导UPR效应的关系
1.5 本课题的研究意义以及主要内容
1.5.1 本课题的研究意义
1.5.2 本课题的研究内容
第二章 基于CRISPR-HDR技术的黑曲霉基因的大片段敲除以及多片段、多拷贝插入平台的建立
2.1 引言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 主要试剂/试剂盒
2.2.3 质粒载体
2.2.4 菌种
2.2.5 培养基配方
2.2.6 引物序列
2.3 实验方法
2.3.1 菌体的培养
2.3.2 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因的sg RNA表达质粒的构建
2.3.3 黑曲霉体外转录合成sgRNA
2.3.4 包含Cas9 蛋白表达框、sg RNA表达框的质粒的构建
2.3.5 CRISPR-HDR系统中供体DNA的构建
2.3.6 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因菌株的构建
2.3.7 基于HPLC-MS的黑曲霉次级代谢产物检测
2.3.8 黑曲霉gox C表达转化子中gox C拷贝数的鉴定
2.3.9 黑曲霉胞外蛋白浓度的测定、SDS-PAGE蛋白电泳以及Gox C酶活测定方法
2.4 结果与讨论
2.4.1 黑曲霉CBS531.88 来源的III型启动子的确定
2.4.2 重组表达质粒p FC330-An U61-fwn A和 p FC330-An U62-fwn A在对于黑曲霉CBS513.88中fwn A基因的编辑
2.4.3 烟曲霉来源的U6-2启动子、米曲霉来源的U6启动子可以介导黑曲霉中Cas9 蛋白敲除fwn A基因
2.4.4 体外合成sg RNA可以介导Cas9 蛋白突变fwn A基因
2.4.5 CRISPR-HDR介导的位点特异性插入方法的建立
2.4.6 CRISPR-HDR介导的超长片段敲除方法的建立
2.4.7 CRISPR-HDR介导的多位点、多基因插入方法的建立
2.5 小结
第三章 黑曲霉BHLH型转录因子INO2 作用机制以及其调控磷脂合成代谢的探究
3.1 引言
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 主要仪器设备
3.2.2 主要试剂/试剂盒
3.2.3 载体质粒
3.2.4 菌种
3.2.5 引物序列
3.3 实验方法
3.3.1 菌体的培养
3.3.2 质粒图谱以及引物设计
3.3.3 黑曲霉ino2 敲除株/ino2 原位回补株的构建
3.3.4 大肠杆菌蛋白的表达纯化
3.3.5 大肠杆菌蛋白表达纯化以及电泳迁移率实验(EMSA)实验的操作
3.3.6 酵母双杂交实验操作
3.3.7 基于UPLC-MS/MS方法的黑曲霉总磷脂中磷脂酰胆碱的检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 黑曲霉中调控磷脂合成的碱性螺旋-转角-螺旋转录因子ino2的确定
3.4.2 黑曲霉An02g04350p蛋白的酵母双杂交蛋白互作分析
3.4.3 与野生型菌株相比,ino2的缺陷导致细胞PI失衡
3.4.4 黑曲霉中ino2 基因的缺陷会增加对细胞壁干扰、DNA损伤的抗性
3.5 小结
第四章 基于比较转录组学的黑曲霉BHLH型转录因子INO2 调控机制的研究
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 主要仪器设备
4.2.2 主要试剂/试剂盒
4.2.3 菌种
4.2.4 引物序列
4.3 实验方法
4.3.1 菌体的培养
4.3.2 黑曲霉总RNA的提取、去基因组以及反转录
4.3.3 荧光定量引物设计以及qPCR实验
4.3.4 RNA-seq测序
4.3.5 RNA-seq数据的生物信息学分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 黑曲霉中ino2 的缺失会抑制肌醇-3-磷酸合酶ino1 的转录
4.4.2 外源肌醇的添加会导致黑曲霉磷脂酰胆碱从头合成途径关键基因的下调
4.4.3 WT、Δino2和INO的总RNA样品制备与质量控制
4.4.4 RNA-seq测序数据的统计学分析
4.4.5 ino2缺失或外源添加肌醇对黑曲霉全基因组水平表达谱影响的Go富集分析
4.4.6 ino2 缺失或外源添加肌醇会使黑曲霉UASINO基因大部分下调,使UASFAS基因大部分上调
4.4.7 ino2 的缺失以及外源添加肌醇会使PI合成途径相关基因下调,造成PI失衡
4.4.8 黑曲霉中PI失衡会抑制UPR相关基因笔记内质网相关的降解途径(ERAD)
4.4.9 ino2 的缺失以及外源肌醇的添加会使黑曲霉对细胞壁损伤、DNA损伤有较强抗性
4.5 小结
第五章 基于比较脂质组学与转录组学的对磷脂稳态失衡与内质网蛋白稳态失衡互相影响的研究
5.1 引言
5.2 实验材料与仪器
5.2.1 主要仪器设备
5.2.2 主要试剂/试剂盒
5.2.3 载体质粒
5.2.4 菌种
5.2.5 引物序列
5.2.6 基因敲除、回补实验方案
5.3 实验方法
5.3.1 菌体的培养
5.3.2 质粒图谱以及引物设计
5.3.3 黑曲霉基因缺陷株以及表达株的构建
5.3.4 实时荧光定量实验
5.3.5 RNA-seq以及测序数据的生物信息学分析
5.3.6 基于LC/MS的非靶向脂质组学分析
5.3.7 表型分析
5.4 结果与讨论
5.4.1 黑曲霉中cho2(An15g06310)、opi3(An08g00560)是脂酰乙醇胺(PE)到磷脂酰胆碱(PC)途径关键基因
5.4.2 黑曲霉PE到PC途径合成的缺陷会导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.3 黑曲霉中dgk1(An02g09160)是磷脂酸(PA)合成途径中的关键基因,缺失后导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.4 黑曲霉磷脂稳态失衡株差异脂质KEGG富集分析
5.4.5 黑曲霉总磷脂稳态失衡会导致细胞内质网蛋白稳态失衡
5.4.6 黑曲霉总磷脂稳态失衡株表型变化研究
5.4.7 黑曲霉总磷脂稳态失衡株转录组学分析
5.4.8 黑曲霉hac A缺陷以及hac A持续性激活表达会导致内质网蛋白稳态失衡
5.4.9 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡株转录组学分析
5.4.10 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡会导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.11 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡株差异脂质KEGG富集分析
5.4.12 五组样品中四个脂类相关合成途径基因的转录水平研究
5.4.13 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡表型变化研究
5.5 小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件
【参考文献】：
博士论文
[1]米曲霉蛋白分泌压力反馈调控机制研究[D]. 周斌.华南理工大学 2016
[2]黑曲霉FGSC A1279次级代谢调控研究[D]. 吕扬勇.华南理工大学 2014
硕士论文
[1]葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究[D]. 罗时渝.华南理工大学 2018
[2]猪圆环病毒2型Cap蛋白基因在原核和真核系统中的表达研究[D]. 谢景毅.华南理工大学 2017
[3]黑曲霉来源脯氨酰蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究[D]. 何攀.华南理工大学 2014
[4]黑曲霉酸性蛋白酶基因在曲霉中表达的研究[D]. 苗小康.华南理工大学 2010
本文编号：3653044
【文章页数】：198 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 黑曲霉基因编辑系统
1.1.1 黑曲霉基因编辑系统发展概述
1.1.2 丝状真菌中CRISPR/Cas9 系统的应用现状
1.1.3 黑曲霉中CRISPR系统目前所面临的一些问题
1.2 黑曲霉蛋白合成分泌与内质网UPR机制的关系
1.2.1 黑曲霉蛋白分泌途径概述
1.2.2 丝状真菌内质网的UPR效应机制
1.2.3 内质网UPR机制在丝状真菌蛋白生产中的应用
1.3 真菌内质网UPR效应与膜结构相互影响
1.3.1 真菌内质网结构概述
1.3.2 内质网脂质的扰动可以激活内质网UPR效应
1.3.3 真菌磷脂相关代谢物的扰动可以激活UPR效应
1.4 真菌磷脂合成机制
1.4.1 真菌磷脂合成途径
1.4.2 真菌磷脂合成的遗传调控
1.4.3 肌醇对于真核微生物磷脂合成的调控
1.4.4 磷脂代谢调控与内质网压力诱导UPR效应的关系
1.5 本课题的研究意义以及主要内容
1.5.1 本课题的研究意义
1.5.2 本课题的研究内容
第二章 基于CRISPR-HDR技术的黑曲霉基因的大片段敲除以及多片段、多拷贝插入平台的建立
2.1 引言
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 主要仪器设备
2.2.2 主要试剂/试剂盒
2.2.3 质粒载体
2.2.4 菌种
2.2.5 培养基配方
2.2.6 引物序列
2.3 实验方法
2.3.1 菌体的培养
2.3.2 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因的sg RNA表达质粒的构建
2.3.3 黑曲霉体外转录合成sgRNA
2.3.4 包含Cas9 蛋白表达框、sg RNA表达框的质粒的构建
2.3.5 CRISPR-HDR系统中供体DNA的构建
2.3.6 黑曲霉CRISPR敲除fwn A基因菌株的构建
2.3.7 基于HPLC-MS的黑曲霉次级代谢产物检测
2.3.8 黑曲霉gox C表达转化子中gox C拷贝数的鉴定
2.3.9 黑曲霉胞外蛋白浓度的测定、SDS-PAGE蛋白电泳以及Gox C酶活测定方法
2.4 结果与讨论
2.4.1 黑曲霉CBS531.88 来源的III型启动子的确定
2.4.2 重组表达质粒p FC330-An U61-fwn A和 p FC330-An U62-fwn A在对于黑曲霉CBS513.88中fwn A基因的编辑
2.4.3 烟曲霉来源的U6-2启动子、米曲霉来源的U6启动子可以介导黑曲霉中Cas9 蛋白敲除fwn A基因
2.4.4 体外合成sg RNA可以介导Cas9 蛋白突变fwn A基因
2.4.5 CRISPR-HDR介导的位点特异性插入方法的建立
2.4.6 CRISPR-HDR介导的超长片段敲除方法的建立
2.4.7 CRISPR-HDR介导的多位点、多基因插入方法的建立
2.5 小结
第三章 黑曲霉BHLH型转录因子INO2 作用机制以及其调控磷脂合成代谢的探究
3.1 引言
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 主要仪器设备
3.2.2 主要试剂/试剂盒
3.2.3 载体质粒
3.2.4 菌种
3.2.5 引物序列
3.3 实验方法
3.3.1 菌体的培养
3.3.2 质粒图谱以及引物设计
3.3.3 黑曲霉ino2 敲除株/ino2 原位回补株的构建
3.3.4 大肠杆菌蛋白的表达纯化
3.3.5 大肠杆菌蛋白表达纯化以及电泳迁移率实验(EMSA)实验的操作
3.3.6 酵母双杂交实验操作
3.3.7 基于UPLC-MS/MS方法的黑曲霉总磷脂中磷脂酰胆碱的检测
3.4 结果与讨论
3.4.1 黑曲霉中调控磷脂合成的碱性螺旋-转角-螺旋转录因子ino2的确定
3.4.2 黑曲霉An02g04350p蛋白的酵母双杂交蛋白互作分析
3.4.3 与野生型菌株相比,ino2的缺陷导致细胞PI失衡
3.4.4 黑曲霉中ino2 基因的缺陷会增加对细胞壁干扰、DNA损伤的抗性
3.5 小结
第四章 基于比较转录组学的黑曲霉BHLH型转录因子INO2 调控机制的研究
4.1 引言
4.2 实验材料与仪器
4.2.1 主要仪器设备
4.2.2 主要试剂/试剂盒
4.2.3 菌种
4.2.4 引物序列
4.3 实验方法
4.3.1 菌体的培养
4.3.2 黑曲霉总RNA的提取、去基因组以及反转录
4.3.3 荧光定量引物设计以及qPCR实验
4.3.4 RNA-seq测序
4.3.5 RNA-seq数据的生物信息学分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 黑曲霉中ino2 的缺失会抑制肌醇-3-磷酸合酶ino1 的转录
4.4.2 外源肌醇的添加会导致黑曲霉磷脂酰胆碱从头合成途径关键基因的下调
4.4.3 WT、Δino2和INO的总RNA样品制备与质量控制
4.4.4 RNA-seq测序数据的统计学分析
4.4.5 ino2缺失或外源添加肌醇对黑曲霉全基因组水平表达谱影响的Go富集分析
4.4.6 ino2 缺失或外源添加肌醇会使黑曲霉UASINO基因大部分下调,使UASFAS基因大部分上调
4.4.7 ino2 的缺失以及外源添加肌醇会使PI合成途径相关基因下调,造成PI失衡
4.4.8 黑曲霉中PI失衡会抑制UPR相关基因笔记内质网相关的降解途径(ERAD)
4.4.9 ino2 的缺失以及外源肌醇的添加会使黑曲霉对细胞壁损伤、DNA损伤有较强抗性
4.5 小结
第五章 基于比较脂质组学与转录组学的对磷脂稳态失衡与内质网蛋白稳态失衡互相影响的研究
5.1 引言
5.2 实验材料与仪器
5.2.1 主要仪器设备
5.2.2 主要试剂/试剂盒
5.2.3 载体质粒
5.2.4 菌种
5.2.5 引物序列
5.2.6 基因敲除、回补实验方案
5.3 实验方法
5.3.1 菌体的培养
5.3.2 质粒图谱以及引物设计
5.3.3 黑曲霉基因缺陷株以及表达株的构建
5.3.4 实时荧光定量实验
5.3.5 RNA-seq以及测序数据的生物信息学分析
5.3.6 基于LC/MS的非靶向脂质组学分析
5.3.7 表型分析
5.4 结果与讨论
5.4.1 黑曲霉中cho2(An15g06310)、opi3(An08g00560)是脂酰乙醇胺(PE)到磷脂酰胆碱(PC)途径关键基因
5.4.2 黑曲霉PE到PC途径合成的缺陷会导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.3 黑曲霉中dgk1(An02g09160)是磷脂酸(PA)合成途径中的关键基因,缺失后导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.4 黑曲霉磷脂稳态失衡株差异脂质KEGG富集分析
5.4.5 黑曲霉总磷脂稳态失衡会导致细胞内质网蛋白稳态失衡
5.4.6 黑曲霉总磷脂稳态失衡株表型变化研究
5.4.7 黑曲霉总磷脂稳态失衡株转录组学分析
5.4.8 黑曲霉hac A缺陷以及hac A持续性激活表达会导致内质网蛋白稳态失衡
5.4.9 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡株转录组学分析
5.4.10 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡会导致细胞总磷脂稳态失衡
5.4.11 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡株差异脂质KEGG富集分析
5.4.12 五组样品中四个脂类相关合成途径基因的转录水平研究
5.4.13 黑曲霉内质网蛋白稳态失衡表型变化研究
5.5 小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果
致谢
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【参考文献】：
博士论文
[1]米曲霉蛋白分泌压力反馈调控机制研究[D]. 周斌.华南理工大学 2016
[2]黑曲霉FGSC A1279次级代谢调控研究[D]. 吕扬勇.华南理工大学 2014
硕士论文
[1]葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的高效重组表达及酶学性质研究[D]. 罗时渝.华南理工大学 2018
[2]猪圆环病毒2型Cap蛋白基因在原核和真核系统中的表达研究[D]. 谢景毅.华南理工大学 2017
[3]黑曲霉来源脯氨酰蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究[D]. 何攀.华南理工大学 2014
[4]黑曲霉酸性蛋白酶基因在曲霉中表达的研究[D]. 苗小康.华南理工大学 2010
本文编号：3653044
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3653044.html
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