电镜单颗粒技术解析尿素酰胺水解酶功能相关的构象变化机制

发布时间：2022-07-08 12:15

　　尿素酰胺水解酶（Urea amidolyase,UA）属于生物素依赖的羧化酶家族,能够将尿素转化为氨,在自然界氮循环中具有重要作用。尿素酰胺水解酶是一种广泛分布于细菌,真菌,藻类和植物中的双功能酶。在UA进行尿素转化时,需要其C端生物素羧化酶（BC）、羧基转移酶（CT）及N端脲基甲酸盐水解酶（AH）结构域间的紧密协同,以实现底物/产物的顺序传递和与相应酶活的联动,从而依次完成生物素羧化、羧基转移至尿素、脲基甲酸盐水解等步骤。有意思的是,虽然同家族的其他成员均通过寡聚体的形式来完成对底物的羧化,但UA的酶活不依赖于寡聚。UC与AH结构域各自的晶体结构已知,但前者仅捕捉到拟羧基转移状态的构象,由于结晶不成功,酶的全长结构仍未解决,因而其整体构架及工作过程中介导结构域间通讯的长程构象变化还不清楚。在前期工作中,我们已经获得了高度均一的乳酸酵母UA（kluyveromyces lactis,KIUA）全酶。本论文首次通过单颗粒透射电镜技术报道了KIUA可溶性同源二聚体形式的整体结构及构象变化形式。无论KIUA是否与配体和底物一起孵育,所解析的结构都代表了一种中间状态,即生物素-羧基载体蛋白（B... 

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 氮元素在自然界中的循环
    1.2 生物素依赖性羧化酶家族
        1.2.1 乙酰辅酶A羧化酶
        1.2.2 丙酮酸羧化酶
        1.2.3 丙酰辅酶A羧化酶
    1.3 尿素酰胺水解酶简介
        1.3.1 尿素羧化酶结构和功能
        1.3.2 脲基甲酸盐水解酶结构和功能
    1.4 KIUA发挥酶活变构机制的独特性分析
    1.5 与KIUA相关的现有生物素依赖性羧化酶晶体结构分析
    1.6 KIUA的变构机制假说
    1.7 小结
第二章 不同状态下尿素酰胺水解酶的电镜观察
    2.1 实验方法
        2.1.1 负染色技术概述
        2.1.2 负染色技术原理
        2.1.3 透射电镜简介
        2.1.4 透射电镜使用前操作及调试
        2.1.5 负染制样前准备
        2.1.6 负染制样方法
    2.2 对KlUA、KlUA+ADP和 KlUA+ADP+Urea的负染观察
    2.3 小结
第三章 不同状态下尿素酰胺水解酶的三维结构
    3.1 实验方法
        3.1.1 电镜三维重构技术
    3.2 数据的收集与处理流程
    3.3 三维重构结果
    3.4 实验结果与分析
        3.4.1 KIUA+ADP+urea的三维结构分析
        3.4.2 KIUA+ADP的三维结构分析
        3.4.3 KIUA的三维结构分析
    3.5 讨论与展望
参考文献
致谢



本文编号：3657010