产双果糖酐Ⅲ的菊糖果糖基转移酶的基因克

发布时间：2022-07-16 19:22

　　双果糖酐Ⅲ（difructo se anhydride,DFA Ⅲ）是近年来发现的一种新型天然功能性甜味剂,具有促进矿物质吸收、促进骨骼生长、改善便秘等功能,而且甜度较高但能量较低,并具有良好的理化性质,适用于烘焙、饮料、医药制剂中。但是DFA Ⅲ在自然界中含量较低,利用提取分离的手段获得产品的成本较高;而通过利用化学法制备DFA Ⅲ也存在产物中同分异构体较多,分离纯化困难,并且污染环境等问题。因此,该产品目前主要是采用生物法制备:利用菊糖果糖基转移酶（IFTase）催化菊糖分解生成DFA Ⅲ。该方法转化率高,安全可靠,并且菊糖来源广泛,适用于大规模工业化生产,是近年来研究的热点。但是现有的IFTase普遍存在酶活性不高,转化率低,生产成本高等问题,因此利用现代分子生物学手段获得新的IFTase,提高催化效率,降低转化成本对于推动DFA Ⅲ的广泛应用十分重要。本研究首先通过生物信息分析,对IFTase的氨基酸序列进行对比,通过分子克隆和表达,获得来源于克雷伯氏菌的目的基因编码的酶Kp-IFTase。经初步鉴定,该酶具有催化菊糖分解生成双果糖苷Ⅲ及其它果寡糖的功能。该酶具有良好的耐热性并... 

【文章页数】：104 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 新型功能性甜味剂双果糖酐Ⅲ
        1.1.1 双果糖酐Ⅲ的功能性质
        1.1.2 双果糖酐Ⅲ合成策略
    1.2 菊糖果糖基转移酶的研究进展
        1.2.1 菊糖果糖基转移酶的研究概述
        1.2.2 菊糖果糖基转移酶的酶学性质
        1.2.3 菊糖果糖基转移酶的催化反应机理
    1.3 构建高效质粒载体
        1.3.1 分子克隆的策略
        1.3.2 消除非重组背景
    1.4 宏基因组学简介
        1.4.1 宏基因组学研究策略
        1.4.2 基因组DNA的提取
    1.5 酶固定化方法的研究概述
        1.5.1 交联酶聚集体技术的发展及应用
        1.5.2 凝结多糖的性质及凝胶材料的应用
        1.5.3 仿生硅技术的研究进展
        1.5.4 介孔材料的研究进展
    1.6 研究的目的和意义
第二章 一种克雷伯氏菌的IFTase的分子克隆及酶学性质的研究
    2.1 试验材料与仪器
        2.1.1 试验材料
        2.1.2 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 扩增与Aa-IFTase氨基酸序列同源性较高的基因片段及其克隆
        2.2.2 对pANY2-Kp-IFTase质粒的定点突变
        2.2.3 Kp-IFTase的表达与催化产物的鉴定
        2.2.4 Kp-IFTase酶学性质的研究
    2.3 结果与分析
        2.3.1 扩增与Aa-IFTase氨基酸序列同源性较高的基因片段及其克隆
        2.3.2 对pANY2-Kp-IFTase质粒的定点突变及酶活鉴定
        2.3.3 Kp-IFTase的表达与催化产物的鉴定
        2.3.4 Kp-IFTase酶学性质的研究
    2.4 结论
第三章 一种用于多种克隆策略的表达载体的构建,功能验证及Aa-IFTase基因的克隆
    3.1 试验材料与仪器
        3.1.1 试验材料
    3.2 试验方法
        3.2.1 质粒载体pANY1 的构建
        3.2.2 pANY1 用于Aa-IFTase基因进行粘性末端克隆的功能验证
        3.2.3 pANY1 用于平末端克隆的功能验证
        3.2.4 pANY1 用于TA克隆的功能验证
        3.2.5 pANY1 用于重组酶克隆的功能验证
        3.2.6 pANY1 用于一种基于PCR产物退火反应的克隆策略
        3.2.7 pANY1 用于蛋白表达和蛋白纯化的功能验证
    3.3 结果与分析
        3.3.1 质粒载体pANY1 的构建
        3.3.2 pANY1 用于Aa-IFTase基因进行粘性末端克隆的功能验证
        3.3.3 pANY1 用于平末端克隆的功能验证
        3.3.4 pANY1 用于TA克隆的功能验证
        3.3.5 pANY1 用于重组酶克隆的功能验证
        3.3.6 pANY1 用于一种基于PCR产物退火反应的克隆策略
        3.3.7 pANY1 用于蛋白表达和蛋白纯化的功能验证
    3.4 结论
第四章 利用宏基因组区段改组法对Aa-IFTase进行分子改造
    4.1 试验材料与仪器
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 菊糖果糖基转移酶(Aa-IFTase)基因的克隆与表达
        4.2.2 菊糖果糖基转移酶(Aa-IFTase)催化菊糖反应产物鉴定
        4.2.3 提取土壤微生物基因组DNA并采用高通量16s rDNA测序检测
        4.2.4 分析基于石英砂提取土壤微生物基因组DNA方法的偏好性
        4.2.5 利用基于石英砂的方法提取多种生物的基因组DNA
        4.2.6 土壤样品微生物群落多样性分析
        4.2.7 基于石英砂的方法提取五份不同土壤微生物的基因组DNA
        4.2.8 基于土壤微生物多样性设计简并引物
        4.2.9 构建宏基因组区段改组库
        4.2.10 重组子的筛选与IFTase酶活的鉴定
    4.3 结果与分析
        4.3.1 菊糖果糖基转移酶(Aa-IFTase)基因的克隆与表达
        4.3.2 菊糖果糖基转移酶(Aa-IFTase)催化菊糖反应产物鉴定
        4.3.3 提取土壤微生物基因组DNA并采用高通量16s rDNA测序检测
        4.3.4 分析基于石英砂提取土壤微生物基因组DNA方法的偏好性
        4.3.5 利用基于石英砂的方法提取多种生物的基因组DNA
        4.3.6 土壤样品微生物群落多样性分析
        4.3.7 基于石英砂的方法提取五份不同土壤微生物总DNA
        4.3.8 基于土壤微生物多样性设计简并引物
        4.3.9 构建宏基因组区段改组库
        4.3.10 重组子的筛选与IFTase酶活的鉴定
    4.4 结论
第五章 基于凝结多糖制备介孔CLEAs-仿生硅复合微球包埋菊糖果糖基转移酶
    5.1 试验材料与仪器
        5.1.1 试验材料
        5.1.2 主要仪器
    5.2 试验方法
        5.2.1 基于凝结多糖的介孔CLEAs-仿生硅复合微球的制备及包埋条件的优化
        5.2.2 复合微球的表征
        5.2.3 各种因素对游离酶和固定化酶活力的影响
        5.2.4 游离酶和固定化酶的稳定性
        5.2.5 固定化酶的重复使用性能
    5.3 结果与分析
        5.3.1 基于凝结多糖的介孔CLEAs-仿生硅复合微球的制备及包埋条件的优化
        5.3.2 固定化复合微球的表征
        5.3.3 各种因素对游离酶和固定化酶活力的影响
        5.3.4 游离酶和固定化酶的稳定性
        5.3.5 固定化酶的重复使用性能
    5.4 结论
第六章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表文章


【参考文献】：
期刊论文
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[4]双酶法提取牛蒡多糖的研究[J]. 高明侠,苗敬芝,曹泽虹,董玉玮,吕兆启.  食品科学. 2008(09)
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本文编号：3663130