拟南芥叶绿体PPIase突变体的创建及表型初步分析

发布时间：2022-07-22 16:53

　　肽基脯氨酰顺反异构酶（Peptidyl Prolyl cis/trans Isomerase,PPIase）存在于各种生物体中,它的主要功能是通过催化多肽链中X-Pro肽键从顺式向反式转化,加速蛋白质的折叠,是蛋白质折叠的限速酶。植物的叶绿体中有很多PPIase,我们对它们的功能知之甚少。本研究主要用CRISPR/Cas9基因编辑技术和T-DNA突变体筛选方法创建拟南芥叶绿体部分PPIase的缺失突变体,然后对它们生长表型及其在光合作用中的生理功能进行分析,增加对叶绿体PPIase和光合作用的认识。拟南芥叶绿体基质中共有3个PPIases蛋白,分别是CYP20-3、TIG和PIN3。本研究通过鉴定T-DNA插入突变体,得到了缺失突变体cyp20-3（SALK＿001615）、tig（SALK＿037730）和pin3（GK＿068C12）,然后通过杂交得到了cyp20-3×tig双重突变体。在表型分析实验中,发现单基因突变体和cyp20-3×tig双重突变体的表型与野生型相比在生长发育方面没有明显的差异,我们推测基质PPIase蛋白可能与其它蛋白的功能存在冗余现象。利用BN-PAGE实... 

【文章页数】：98 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 光合作用
        1.1.1 PSⅠ和 PSⅡ
        1.1.2 光合电子传递链
    1.2 PPIase
        1.2.1 拟南芥PPIase蛋白研究进展
        1.2.2 拟南芥叶绿体PPIase蛋白研究进展
    1.3 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
        1.3.1 CRISPR/Cas9 组成与作用方式
        1.3.2 CRISPR/Cas9 的应用
    1.4 本课题研究的意义
第二章 基质PPIase突变体的获得
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 主要仪器与试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 突变体DNA水平鉴定方法
        2.2.2 突变体RNA水平鉴定方法
    2.3 实验结果与分析
        2.3.1 CYP20-3 T-DNA插入突变体的鉴定结果与分析
        2.3.2 TIG T-DNA插入突变体的鉴定结果与分析
        2.3.3 PIN3 T-DNA插入突变体的鉴定结果与分析
        2.3.4 T-DNA插入突变体的RNA水平鉴定结果与分析
    2.4 本章小结
第三章 基质PPIase缺失突变体的初步分析
    3.1 基质PPIase突变体表型观察
        3.1.1 材料与试剂
        3.1.2 实验方法及结果
    3.2 双重突变体和三重突变体的获得
        3.2.1 材料与试剂
        3.2.2 实验方法及结果
    3.3 基质PPIase突变体BN-PAGE分析
        3.3.1 材料与试剂
        3.3.2 BN-PAGE实验原理与方法
        3.3.3 BN-PAGE实验结果与分析
    3.4 TIG互补植株获得
        3.4.1 材料与试剂
        3.4.2 实验方法
        3.4.3 实验结果与分析
    3.5 本章小结
第四章 类囊体腔PPIase突变体的获得
    4.1 材料与试剂
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要仪器与试剂
        4.1.3 网站信息
    4.2 FKBP16-4 T-DNA插入突变体鉴定方法
    4.3 CRISPR/Cas9 创建突变体方法
        4.3.1 设计gRNA spacer
        4.3.2 扩增tRNA-gRNA小片段所需模板及引物
        4.3.3 扩增tRNA-gRNA小片段
        4.3.4 片段纯化
        4.3.5 酶切连接
        4.3.6 酶切连接验证
        4.3.7 PTG片段连接pMD18-T
        4.3.8 大肠杆菌转化
        4.3.9 单克隆验证
        4.3.10 测序保种及提质粒
        4.3.11 目的片段与pRGEB32载体连接及转化
        4.3.12 农杆菌转化
        4.3.13 花浸染法侵染野生型拟南芥
        4.3.14 转基因植株鉴定
    4.4 FKBP16-4 T-DNA插入突变体鉴定结果与分析
        4.4.1 FKBP16-4 T-DNA插入突变体DNA水平鉴定结果与分析
        4.4.2 FKBP16-4 T-DNA插入突变体RNA水平鉴定结果与分析
    4.5 CRISPR/Cas9 创建突变体鉴定结果与分析
        4.5.1 gRNA spacer的设计
        4.5.2 tRNA-gRNA引物设计及小片段合成
        4.5.3 小片段纯化及酶切连接结果
        4.5.4 连接pMD18-T结果
        4.5.5 PTG连接pRGEB32 结果
        4.5.6 突变体筛选结果
    4.6 本章小结
第五章 类囊体腔部分PPIase缺失突变体的初步分析
    5.1 FKBP16-4初步探究
        5.1.1 材料与试剂
        5.1.2 实验方法
        5.1.3 实验结果与分析
    5.2 FKBP13、FKBP17-1、FKBP18 初步探究
        5.2.1 材料与试剂
        5.2.2 实验方法与结果
    5.3 本章小结
结论
参考文献
附表1
附表2
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR基因编辑技术及其应用与检测方法[J]. 石伟佳,刘芳.  农业与技术. 2020(04)
[2]光系统Ⅰ（PSⅠ）的结构与功能研究进展[J]. 郁飞,唐崇钦,辛越勇,彭德川,许亦农,李良璧,匡廷云.  植物学通报. 2001(03)



本文编号：3664985