基于PAPS结合蛋白HAL2的PAPS纯化与检测系统的建立与应用

发布时间：2022-08-12 19:29

　　硫元素是参与生命活动的重要非金属元素之一。硫酸盐进入细胞后,由ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）催化生成腺苷-5’-磷腺硫酸（Adenosine-5’-phosphorus sulfate,APS）,APS在APS还原酶的催化下生成亚硫酸,或者在APS激酶催化下生成3’-磷酸-腺苷5’-磷酰硫酸（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate,PAPS）。PAPS是合成硫代葡萄糖苷的原料之一,也是大规模合成肝素类多糖的一个关键原料,是胞内硫酸化反应的唯一硫酸根供体。硫酸转移酶以PAPS为底物硫酸化生成磺酸物,其副产物为3’,5’-二磷酸腺苷（3’,5’-biphosphate adenosine,PAP）,生成的PAP在3’腺苷酸酶的催化下生成单磷酸腺苷AMP和无机磷酸。PAPS在生物材料中含量甚微,商品化PAPS价格贵且纯度低。本研究以PAP/PAPS结合蛋白为工具,建立了从生物材料中纯化和富集PAPS的方法,并进行了定量分析。酵母3’,5’二磷酸核苷酸酶（3’,5’bisphosphate nucleotidase,BPNT或者HAL2）可... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
    1 硫酸盐的同化代谢
        1.1 硫的生物学功能
        1.2 硫同化途径
    2 PAPS的合成、运输及鉴定分析
        2.1 PAPS胞内合成及运输
        2.2 PAPS的生物学作用
        2.3 PAPS的鉴定分析
    3 PUF蛋白相关研究
    4 研究目的及意义
第2章 麦芽糖结合蛋白-酵母3',5'二磷酸核苷酸酶融合蛋白表达体系的构建及应用
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 试验材料试剂
        2.2 表达载体的构建
        2.3 MBP-HAL2 融合蛋白的表达及纯化
        2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
        2.5 Braford法定量蛋白质浓度
        2.6 融合蛋白结合PAP的分析
    3 结果与结论
        3.1 p MAL-HAL2 载体构建
        3.2 p ET24-MBPHAL2 表达载体构建
        3.3 MBP-HAL2 融合蛋白的表达及纯化
        3.4 融合蛋白MBP-HAL2 定量
        3.5 MBP-HAL2 融合蛋白结合PAP
    4 小结
第3章 PAP/PAPS体外富集及定量分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料与试剂
        2.2 细菌核苷酸的提取
        2.3 利用MBP-HAL2 融合蛋白富集PAP/PAPS
        2.4 PAP/PAPS定量分析
    3 结果
        3.1 硫酸盐处理影响大肠杆菌核苷酸量
        3.2 富集样品中PAP/PAPS的定量分析
    4 小结
第4章 PAP/PAPS胞内浓度调节的初探
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料与试剂
        2.2 构建His9-PUF表达体系
        2.3 细菌生长曲线测定
        2.4 构建p ETDuet-PUF和 p ET24a-Cys Q共表达体系
        2.5 PUF蛋白RNA结合域与目标RNA片段的互作分析
    3 结果
        3.1 PUF12的诱导表达没有影响大肠杆菌的生长
        3.2 PUF12 的诱导表达没有影响大肠杆菌Cys Q蛋白质的表达
        3.3 PUF12 的诱导表达没有影响大肠杆菌Cys Q的转录
        3.4 PUF12与目标寡核苷酸的互作具有核酸长度依赖性
    4 结论
结论与展望
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢



本文编号：3676461