利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

发布时间：2022-08-23 10:50

　　目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA（guide RNA）靶点,体外转录得到sgRNA（small guide RNA）并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。 

【文章页数】：8 页

【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 实验动物
    1.2 主要试剂与仪器
    1.3 实验方法
        1.3.1 根据Bpi序列结构，分析CRISPR/gRNA靶点设计位置
        1.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录与靶点活性检测
        1.3.3 小鼠超数排卵、受精卵注射以及胚胎移植
        1.3.4 F0代小鼠的基因型鉴定和DNA测序
        1.3.5 F0代小鼠的饲养与扩繁
2 结果
    2.1 CRISPR/gRNA靶点设计
    2.2 高活性Cas9/gRNA敲除靶点筛选
    2.3 F0代小鼠的鉴定及子代繁育
3 讨论
    3.1 Bpi基因敲除小鼠遗传稳定品系的建立
    3.2 CRISPR/Cas9技术基因敲除小鼠的脱靶风险
    3.3 Bpi基因敲除小鼠的表型变化
    3.4 构建Bpi基因敲除小鼠的意义
    3.5 Bpi———潜在的新型抗菌药物


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于CRISPR/Cas9技术构建多重sgRNA实现在人原代T细胞中敲除ADRB2基因[J]. 孙毓,刘丹,施明,郑骏年.  中国实验血液学杂志. 2019(05)
[2]CRISPR/Cas9基因编辑技术在肿瘤研究及治疗中的应用[J]. 王韶嵘,高兴春,陈芳妮,乔文伟,米亚静.  实用癌症杂志. 2019(07)
[3]猪杀菌性/通透性增强蛋白（BPI）的功能及其在抗病育种中应用的研究进展[J]. 戴超辉,董文华,吴嘉韵,包文斌,吴圣龙.  中国畜牧兽医. 2016(10)
[4]BPI-BD3融合抗菌肽修饰C3H10T1/2细胞对小鼠感染创面愈合的影响[J]. 张欣然,刘翠,钱智勇,徐红梅,郭希民,郭红延.  解放军医学杂志. 2015(09)
[5]杀菌蛋白rBPI23与haFGF融合基因及真核表达质粒的构建[J]. 彭海英,朱家勇.  临床和实验医学杂志. 2009(12)
[6]杀菌/渗透增强蛋白在小鼠组织器官和细胞中的分布[J]. 郭玲,许晴,吕喆,刘振龙,范宜强,王炜,孔庆利,安云庆.  首都医科大学学报. 2009(05)

硕士论文
[1]鱼类来源的两种抗菌肽BPI和LEAP2的cDNA克隆及重组表达载体的构建[D]. 高北.上海海洋大学 2013
[2]牛杀菌—通透性增加蛋白和防御素基因融合质粒的构建及其在大肠杆菌中表达[D]. 胡伶俐.华中农业大学 2010



本文编号：3677628