毕赤酵母来源Kex2蛋白酶的高效表达及酶学性质研究

发布时间：2022-11-12 07:14

　　Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶,能识别并切割碱性氨基酸残基对中的羧基端肽键,在酵母的蛋白分泌途径中起关键作用,并且在真核细胞蛋白的研究中也应用广泛。目前多用毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）来表达Kex2蛋白酶,但有关毕赤酵母Kex2蛋白酶（PPKex2）的同源活性表达与酶学性质的研究还鲜有报道,并且Kex2蛋白酶较低的表达量导致其生产成本过高,不利于大规模的应用。本课题利用毕赤酵母表达系统对PPKex2进行了同源表达,并研究其酶学性质,同时与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）Kex2蛋白酶（SCKex2）进行了比较。并采用高密度扩大发酵、截短C端序列、更换启动子和伴侣蛋白共表达等方式提高PPKex2的表达量。主要研究成果如下所述:（1）分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得kex2基因,将其插入到表达载体pPIC9K中,并转化毕赤酵母GS115菌株。重组菌株经甲醇诱导表达后,结果表明PPKex2的蛋白浓度达到0.42 mg·mL^-1,酶活达到30.2 U·L^... 

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 立题意义
    1.2 国内外研究进展
        1.2.1 Kex2 蛋白酶简介
        1.2.2 Kex2 蛋白酶的应用现状
        1.2.3 毕赤酵母表达系统概述
        1.2.4 实现毕赤酵母高效表达的策略
        1.2.5 毕赤酵母启动子研究应用现状
        1.2.6 毕赤酵母伴侣蛋白共表达研究应用现状
        1.2.7 毕赤酵母发酵优化策略
    1.3 主要研究思路和研究内容
        1.3.1 主要研究思路
        1.3.2 主要研究内容
        1.3.3 课题来源
第二章 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株与质粒
        2.1.2 培养基与溶液
        2.1.3 主要试剂与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 P.pastoris GS115 感受态细胞的制备
        2.2.2 PPKex2和SCKex2 表达质粒及工程菌的构建
        2.2.3 PPKex2的C端截短表达质粒及工程菌的构建
        2.2.4 启动子改造质粒及工程菌的构建
        2.2.5 共表达伴侣蛋白质粒及表达菌株的构建
        2.2.6 表达菌株的生长及目的蛋白的表达
        2.2.7 Kex2 蛋白酶酶活力测定方法
        2.2.8 Kex2 蛋白酶的纯化与鉴定
        2.2.9 Kex2 蛋白酶的酶学性质的研究
        2.2.10 重组菌株3 L发酵罐高密度发酵和发酵优化
第三章 结果与讨论
    3.1 PPKex2和SCKex2 的表达与纯化
        3.1.1 毕赤酵母中PPKex2和SCKex2 的表达
        3.1.2 PPKex2和SCKex2 的分离纯化与鉴定
    3.2 PPKex2和SCKex2 的酶学性质比较
        3.2.1 最适反应pH和最适反应温度的研究
        3.2.2 pH稳定性和温度稳定性的研究
        3.2.3 动力学参数的测定
    3.3 PPKex2 重组菌株的高密度发酵优化
        3.3.1 PPKex2的3 L发酵罐高密度扩大发酵
        3.3.2 添加辅助表达物对PPKex2 表达的影响
    3.4 PPKex2的C端截短(SPPKex2)以提高表达量的研究
        3.4.1 SPPKex2的C端截短序列的确定
        3.4.2 SPPKex2 在毕赤酵母中的表达
    3.5 启动子改造对PPKex2 表达量的影响
        3.5.1 启动子改造菌株的构建与表达
        3.5.2 双启动子共表达菌株的构建与表达
    3.6 伴侣蛋白共表达对PPKex2 表达量的影响
主要结论与展望
    主要结论
    展望
致谢
参考文献
附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]毕赤酵母高效表达外源蛋白的相关策略及研究进展[J]. 朱文,胡又佳,谢丽萍.  中国医药工业杂志. 2018(04)
[2]启动子的类型及应用[J]. 贺飞燕,闫建俊,白云凤,冯瑞云,施俊凤.  山西农业科学. 2017(01)
[3]嗜麦芽寡养单胞菌角蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达[J]. 李光磊,张娟,方真,隆明星,堵国成,陈坚.  生物技术通报. 2016(08)
[4]巴斯德毕赤酵母启动子研究进展[J]. 薛亚慧,楼觉人.  国际生物制品学杂志. 2016 (02)
[5]Kex2蛋白酶在毕赤酵母中的表达、纯化和性质研究[J]. 刘颖颖,王之可,李素霞.  中国生化药物杂志. 2015(01)
[6]双碳源流加对重组毕赤酵母高效表达葡萄糖氧化酶的影响[J]. 沈伊娜,顾磊,张娟,陈坚,堵国成.  生物工程学报. 2013(07)
[7]共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶发酵过程的影响[J]. 卢鑫,喻晓蔚,沙冲,范文来,徐岩.  微生物学通报. 2013(03)
[8]同时利用AOX1和GAP启动子表达SAM合成酶促进重组毕赤酵母中S-腺苷甲硫氨酸积累[J]. 吕中原,钱江潮,储炬,郭美锦,王永红,庄英萍,张嗣良.  工业微生物. 2008(04)

硕士论文
[1]酸性脂肪酶的高效表达、酶学性质及其应用研究[D]. 张晓凤.江南大学 2018
[2]米曲霉脯氨酰内肽酶在毕赤酵母中的表达、酶学特性及其应用研究[D]. 江婷.江南大学 2016
[3]分子伴侣与信号肽对分泌蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的影响研究[D]. 杜济良.中国人民解放军军事医学科学院 2011



本文编号：3705934