大鼠胚胎不同发育阶段羊水间充质干细胞的差异性分析及其相关分子机制探讨

发布时间：2022-12-06 01:45

　　目的:羊水间充质干细胞（AF-MSCs）具有良好的自我再生能力、较强的可塑性以及低免疫原性与低成瘤性,体外生长不易衰老,因此较之成体干细胞具有更好的再生医学前景。然而,由于目前AF-MSCs的体外培养缺乏统一标准,导致其生物学特点存在多样性,各项研究之间缺乏可比性,难以明确不同胎龄来源的AF-MSCs之间的差异,因而阻碍了其在临床的应用。此外,虽然AF-MSCs的形态、增殖及分化的异质性被广泛认知,然而其异质性的起源及异质性引发差异的机制还不甚明了,亟需一些技术手段对此进行分析。而转录组测序是研究特定细胞在某一发育阶段或功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定的生物学过程,它已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。因此应用转录组对不同发育阶段AF-MSCs进行研究,可以帮助我们进一步了解不同发育阶段AF-MSCs差异产生的原因,让干细胞治疗更好的有的放矢。研究方法:1.AF-MSCs的分离及培养无菌条件下吸取大鼠E12、E15、E18及E21的羊水,4℃离心（1800转）15分钟,PBS清洗2遍,用含10%胎牛血清的DMEM/F... 

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分:大鼠胚胎不同发育阶段羊水间充质干细胞的生物学特性研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 试剂和材料
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 实验动物
            2.2.2 孕鼠羊水采集
            2.2.3 AF-MSCs培养
            2.2.4 AF-MSCs表面标志物鉴定
            2.2.5 AF-MSCs诱导分化及固定染色
            2.2.6 BrdU检测
            2.2.7 AF-MSCs增殖曲线
            2.2.8 AF-MSCs划痕实验
            2.2.9 AF-MSCs transwell小室迁移实验
        2.3 统计方法
    3 结果
        3.1 不同胚胎发育阶段来源的AF-MSCs的培养与鉴定
            3.1.1 不同胚胎发育阶段的AF-MSCs在培养过程中的差异
            3.1.2 表面标志物鉴定
            3.1.3 三系诱导分化能力
        3.2 细胞增殖能力评估
        3.3 细胞迁移能力评估
    4 讨论
    5 结论
第二部分:大鼠胚胎不同发育阶段羊水间充质干细胞的全转录组学分析
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验试剂
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞RNA提取
            2.2.2 AF-MSCs全转录组测序
            2.2.3 生物信息学分析
            2.2.4 个性化分析
    3 结果
        3.1 不同胚胎发育阶段来源AF-MSCs的转录组概况
            3.1.1 检测数据总体分析情况
            3.1.2 不同组差异表达分析
        3.2 生物信息学个性化分析——增殖
        3.3 生物信息学个性化分析——增殖和迁移
    4 讨论
    5 结论
第三部分:miR-351-3p通过靶向Abca4 发挥促AF-MSCs增殖的作用
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验试剂
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞RNA提取
            2.2.2 细胞培养
            2.2.3 Abca4过表达质粒构建
            2.2.4 Abca4 CDS区双萤光素酶质粒构建
            2.2.5 质粒提取
            2.2.6 细胞转染
            2.2.7 实时荧光定量PCR
            2.2.8 细胞蛋白提取与定量
            2.2.9 Western Blot
            2.2.10 细胞增殖曲线
            2.2.11 双萤光素酶报告基因实验
        2.3 统计方法
    3 结果
        3.1 RT-q PCR证实Abca4与miR-351-3p表达量变化趋势一致
        3.2 Abca4 抑制了AF-MSCs的增殖
        3.3 miR-351-3p抑制Abca4 的表达
        3.4 miR-351-3p与 Abca4在CDS区存在结合位点
    4 讨论
    5 结论
第四部分:miR-532-3p通过靶向Chrdl1 发挥促AF-MSCs增殖与迁移的作用
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验试剂
            2.1.2 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 细胞RNA提取
            2.2.2 细胞培养
            2.2.3 过表达质粒构建
            2.2.4 双萤光素酶报告基因质粒构建
            2.2.5 质粒提取
            2.2.6 细胞转染
            2.2.7 实时荧光定量PCR
            2.2.8 细胞蛋白提取与定量
            2.2.9 Western Blot
            2.2.10 细胞增殖曲线
            2.2.11 Transwell细胞迁移实验
            2.2.12 双萤光素酶实验
        2.3 统计方法
    3 结果
        3.1 Chrdl1与miR-532-3p表达趋势与转录组一致
        3.2 Chrdl1 抑制AF-MSCs的增殖
        3.3 Chrdl1 抑制AF-MSCs的迁移
        3.4 miR-532-3p抑制Chrdl1 的表达,促进AF-MSCs的增殖
        3.5 miR-532-3p靶向Chrdl1 促进AF-MSCs的增殖与迁移
    4 讨论
    5 结论
附录
对本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢



本文编号：3710797