双孢蘑菇非特异性过氧合酶AbvbUPO的异源表达及其催化氧化反应研究初探

发布时间：2023-01-12 19:09

　　非特异性过氧合酶（Unspecific Peroxygenases,UPO）是一类来源于真菌的氧化酶,属于血红素氧化酶家族,主要存在于双核菌亚界（Dikarya）和高等真菌界的子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）中。UPO可催化非活化C-H键的羟基化、C=C键的环氧化和硫醚类物质磺化等不同类型的反应,且产物具有区域选择性和立体选择性,被认为是有机化合物氧化功能化的新一代生物催化剂。真菌孢子难于实现高密度发酵,从而导致大量获得野生UPO的提取复杂、能耗大等问题,严重限制了UPO在生物技术应用的可能,寻找适合的异源表达宿主对其进行异源高效表达是解决上述问题的关键。本研究将来源于双孢蘑菇Agaricus bisporus var.bisporus（Abvb）的非特异性过氧合酶Abvb UPO在不同微生物宿主中进行异源重组表达研究,并探究其过氧化氢耐受性,为UPO的异源表达和催化应用提供研究基础。具体研究内容和主要结果如下:（1）双孢蘑菇非特异性过氧合酶的生物信息学分析。利用Ex PASy、Swiss网站和Py MOL软件预测非特异性过氧合酶Abvb UPO... 

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号
第一章 绪论
    1.1 非特异性过氧合酶(UPO)简介
        1.1.1 UPO催化的机制
        1.1.2 UPO的结构研究进展
        1.1.3 UPO的分类
        1.1.4 UPO的应用
            1.1.4.1 UPO在香精香料工业的应用
            1.1.4.2 UPO在生物医药工业的应用
            1.1.4.3 UPO在环境治理方面的应用
        1.1.5 UPO的异源表达研究
    1.2 蛋白质异源表达系统研究进展
        1.2.1 大肠杆菌异源表达系统
        1.2.2 枯草芽孢杆菌异源表达系统
        1.2.3 毕赤酵母异源表达系统
        1.2.4 黑曲霉异源表达系统
        1.2.5 哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统
    1.3 双孢蘑菇Agaricus bisporus
    1.4 研究背景,意义和研究内容
        1.4.1 研究背景与意义
        1.4.2 研究内容
第二章 双孢蘑菇非特异性过氧合酶的生物信息学分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料
    2.3 实验方法
        2.3.1 AbvbUPO的氨基酸序列分析
        2.3.2 AbvbUPO的性质预测
        2.3.3 AbvbUPO的同源建模
    2.4 实验结果和讨论
        2.4.1 AbvbUPO的氨基酸序列分析
        2.4.2 AbvbUPO的性质预测
        2.4.3 AbvbUPO的同源建模
    2.5 本章小结
第三章 双孢蘑菇非特异性过氧合酶的异源表达及其过氧化氢耐受性研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 主要菌株、质粒和基因
        3.2.2 主要生化材料
        3.2.3 主要仪器和设备
        3.2.4 培养基配制
        3.2.5 溶液配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 AbvbUPO表达质粒的构建
        3.3.2 AbvbUPO质粒的表达元件优化及分子伴侣的过表达
        3.3.3 AbvbUPO质粒的转化
        3.3.4 AbvbUPO在不同微生物宿主中的表达
        3.3.5 粗酶液的纯化
        3.3.6 粗酶液的缓冲液置换
        3.3.7 ABTS法测定AbvbUPO酶活
        3.3.8 AbvbUPO过氧化氢耐受性研究
    3.4 结果和讨论
        3.4.1 AbvbUPO重组质粒的构建
        3.4.2 重组AbvbUPO的表达与纯化
            3.4.2.1 AbvbUPO在枯草芽孢杆菌中的表达
            3.4.2.2 AbvbUPO在大肠杆菌中的表达
            3.4.2.3 AbvbUPO在黑曲霉中的表达
            3.4.2.4 AbvbUPO在毕赤酵母中的表达
        3.4.3 ABTS法测定AbvbUPO酶活
        3.4.4 AbvbUPO过氧化氢耐受性研究
    3.5 本章小结
第四章 双孢蘑菇非特异性过氧合酶的催化氧化反应研究初探
    4.1 引言
    4.2 实验材料和仪器
        4.2.1 主要材料和试剂
        4.2.2 主要仪器和设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 AbvbUPO的酶级联催化反应及产物检测
        4.3.2 温度对AbvbUPO的酶级联催化效率的影响
        4.3.3 pH对AbvbUPO的酶级联催化效率的影响
        4.3.4 AbvbUPO催化不同类型氧化反应
            4.3.4.1 羟基化反应
            4.3.4.2 环氧化反应
            4.3.4.3 磺化反应
    4.4 实验结果和讨论
        4.4.1 AbvbUPO的酶级联催化反应及产物检测
        4.4.2 温度对AbvbUPO的酶级联催化效率的影响
        4.4.3 pH对AbvbUPO的酶级联催化效率的影响
        4.4.4 AbvbUPO催化不同类型氧化反应
            4.4.4.1 羟基化反应
            4.4.4.2 环氧化反应
            4.4.4.3 磺化反应
    4.5 本章小结
结论与展望
    结论
    创新点
    展望
参考文献
攻读硕士学位期间所取得的研究成果
致谢
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]烟曲霉脂肪酶B在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究[J]. 唐薇,黄伟谦,杨博,王永华,蓝东明.  食品科学技术学报. 2019(02)
[2]枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望[J]. 张大伟,康倩.  微生物学杂志. 2019(01)
[3]中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化[J]. 张士彬,陈景奇,崔艳艳,谢能中,王敏,张大伟.  食品与发酵工业. 2016(04)
[4]分子伴侣及信号肽对毕赤酵母中分泌蛋白表达水平的影响[J]. 杜济良,赵洪亮,薛冲,任敏,刘志敏.  生物技术通讯. 2013(01)
[5]家蚕在生物制药行业的应用前景[J]. 兰丽盼,吴纯清,姚利娟,朱建忠,朱伟,杨海青.  蚕桑通报. 2012(02)
[6]双孢蘑菇中活性成分的研究进展[J]. 叶明智,黄劲松.  农产品加工(学刊). 2008(10)
[7]基因表达系统研究进展[J]. 孙柏欣,刘长远,陈彦,赵华,赵彤华,李柏宏.  现代农业科技. 2008(02)

硕士论文
[1]脂肪酶MAS1的基因克隆、表达及其性质研究[D]. 瞿曼.华南理工大学 2016
[2]黑曲霉来源脯氨酰蛋白酶在无孢黑曲霉SH-2中表达的研究[D]. 何攀.华南理工大学 2014
[3]二氧化氯对双孢菇贮藏效果的影响及其褐变机理的研究[D]. 崔晶.天津科技大学 2011



本文编号：3730323