基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）质控品制备

发布时间：2023-01-26 01:30

　　目的:制备热稳定性好、耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品。方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP（含PAC位点）基因以及成熟酶蛋白A基因序列（含核糖体结合位点）,先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A。合成包含ORF1ab基因、N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S。通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性。结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃、IPTG 0.3mmol/L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一、直径为23～28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA。加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃... 

【文章页数】：10 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、质粒和主要试剂
        1.1.2 引物和探针
    1.2 方法
        1.2.1 重组载体构建
        1.2.2 重组蛋白的表达与纯化
        1.2.3病毒样颗粒的物理表征
        1.2.4 病毒样颗粒残余核酸去除
        1.2.6 病毒样颗粒稳定性检测
2 结果
    2.1 重组载体的构建
    2.2 目的蛋白的表达和纯化
    2.3 病毒样颗粒的物理表征
    2.4 病毒样颗粒酶消化去除残余核酸
    2.5 病毒样颗粒核酸拷贝数确定
    2.6 病毒样颗粒的热稳定性实验
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]新型冠状病毒RNA标准物质[J]. 许丽,梁文,杨雪,闻艳丽,李兰英,杨镇州,李妍,邓敏,陆青,丁敏,任淑贞,孙洁林,左小磊,王丽华,曹程明,胡钧,刘刚,樊春海.  科学通报. 2020(22)
[2]On the origin and continuing evolution of SARS-CoV-2[J]. Xiaolu Tang,Changcheng Wu,Xiang Li,Yuhe Song,Xinmin Yao,Xinkai Wu,Yuange Duan,Hong Zhang,Yirong Wang,Zhaohui Qian,Jie Cui,Jian Lu.  National Science Review. 2020(06)
[3]新型冠状病毒实验室检测方法及应用[J]. 周婷婷,朱进.  南京医科大学学报(自然科学版). 2020(04)
[4]RNA病毒质控物研究进展[J]. 温和心,龙英全,蒋荣华,盘宝进.  动物医学进展. 2013(01)
[5]耐核糖核酸酶病毒样颗粒的构建和表达[J]. 徐淑芹,黄兴富.  医学检验与临床. 2008(05)
[6]RNA病毒扩增检测的质控品和标准品研究进展[J]. 李金明.  中华检验医学杂志. 2004(12)



本文编号：3732016