SAC-1通过限制ARF-6的GTPase活性以保障囊泡循环运输

发布时间：2023-04-16 23:51

　　在囊泡循环运输过程中,小G蛋白Arf6/ARF-6是调节细胞内体上磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的一个决定性因子。为了进一步了解ARF-6的分子调节过程,我们在秀丽隐杆线虫中展开了对ARF-6结合蛋白的筛选,并从中获得了一个新的ARF-6结合蛋白SAC-1。SAC-1是酵母磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1p在线虫中的同源物。在线虫极性肠上皮细胞中,ARF-6的缺乏会导致基底端内体丧失SAC-1的标记。货物蛋白的稳态分布实验显示,SAC-1缺失会特异性地影响顶膜端的分泌运输途径和基底端的循环运输途径。在sac-1突变动物中,PI(4,5)P2的水平以及ARF-6效应因子UNC-16标记的膜结构都显著增加,提示SAC-1可能是ARF-6的一个负调控因子。进一步研究发现,SAC-1能够与ARF-6的GEF蛋白BRIS-1相互作用,并且BRIS-1与SAC-1的互作能够以浓度依赖的方式减弱BRIS-1与无活性态ARF-6(GDP)的结合。因此,SAC-1缺失会促进细胞内ARF-6(GDP)与GEF蛋白BRIS-1的相互作用。而在sac-1突变动物中,敲降BRIS-1确实会降低PI(4,5)P2水平。值得注意...

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 绪论
第2章 材料和方法
    2.1 秀丽隐杆线虫的基本培养方法
        2.1.1 饲养
        2.1.2 清洁
        2.1.3 冻存
        2.1.4 杂交
        2.1.5 显微注射
    2.2 RNA干扰实验(RNAi)
    2.3 实验中使用的抗体
    2.4 CRISPR/Cas9 体细胞sac-1 基因敲除
    2.5 细胞培养和转染
    2.6 GST pull-down实验
        2.6.1 GST标签蛋白的表达
        2.6.2 GST标签蛋白的纯化
        2.6.3 HA标签蛋白的表达及结合
        2.6.4 SDS-PAGE
    2.7 载体构建和转基因线虫
    2.8 线虫的免疫共沉淀实验
    2.9 PIP免疫染色
    2.10 显微成像和数据分析
第3章 研究结果
    3.1 SAC-1与ARF-6(GTP)和ARF-6(GDP)均相互作用
    3.2 SAC-1 在基底端点状膜结构上的定位依赖于ARF-6(GTP)
    3.3 在sac-1 突变体中CIE蛋白h TAC-GFP阻塞于早内体
    3.4 SAC-1缺失影响肠上皮细胞顶膜端的分泌运输
    3.5 SAC-1 缺失导致PI(4,5)P2 水平急剧上升
    3.6 SAC-1 缺失引起的ARF-6 过激活导致PI(4,5)P2及h TAC-GFP累积
    3.7 SAC-1 缺失导致ARF-6和UNC-16 的胞内累积
    3.8 SAC-1 缺失导致细胞连接蛋白HMP-1 定位异常
    3.9 SAC-1与ARF-6-GEF蛋白BRIS-1 相互作用
    3.10 SAC结构域的催化活性丧失不影响结合BRIS-1
    3.11 SAC-1与ARF-6(T27N)竞争结合BRIS-1/ARF-GEF
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
综述 ARF6 及其效应产物PI(4,5)P2 调控内吞运输
    内吞运输的主要途径
    Arf6调控囊泡循环运输
    PI(4,5)P2调控微丝动态并促进内吞
    参考文献
附录A 转基因和突变线虫株
附录B 常规试剂清单
附录C 缩写词表
附录D 发表论文
致谢



本文编号：3792136