PRRSV BJ3毒株N、Nsp2原核表达及其抗体的制备

发布时间：2023-05-14 05:09

　　PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus)主要会引起断奶仔猪和育肥猪的呼吸道疾病以及母猪的繁殖障碍疾病,被认为是世界上对养猪业危害最严重的病原体之一,每年均会对全球的养猪业造成极大的经济损失。PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属,单股正链单链RNA病毒,基因组长度约为15.4kb,至少由11个开放阅读框(ORF)组成。N蛋白由ORF7编码,分子量约为15k Da,是PRRSV粒子中含量最多、免疫原性最强、保守性最高的蛋白之一,且宿主针对该蛋白的特异性抗体最早产生且存在时间较长,依据N蛋白的这些特性,N蛋白在PRRSV的检测上具良好的诊断学意义。有研究针对N蛋白制备的单克隆抗体可区分I型和Ⅱ型毒株;利用抗N蛋白单克隆鉴定出四个抗原表位。Nsp2是PRRSV基因组中编码最大和变异最大蛋白质,由21%到23%的基因组编码,常作为PRRSV的监控靶点;Nsp2在PRRSV的复制、免疫、引发宿主细胞自噬和凋亡中发挥着重要功能。目前已有研究者以Nsp2蛋白制备的单克隆抗体可区分不同亚型的毒株,利用抗Nsp2蛋白鉴定出新的...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
英文缩略词表
文献综述
    1 PRRSV研究进展
        1.1 PRRSV概述
        1.2 PRRSV生物学特性
            1.2.1 PRRSV非结构蛋白
            1.2.2 PRRSV结构蛋白
        1.3 PRRSV复制及感染机制
    2 单克隆抗体研究进展
        2.1 单克隆抗体概述
        2.2 单克隆抗体制备技术
        2.3 单克隆抗体的应用
        2.4 PRRSV单克隆抗体概述
试验研究
    第一章 PRRSV BJ3 毒株N、Nsp2 基因原核表达及高免血清的制备
        1 材料
            1.1 动物、毒株、菌种和质粒
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 携带PRRSV N、Nsp2 基因克隆载体的构建
                2.1.1 引物
                2.1.2 RNA的提取与反转录
                2.1.3 目的片段的PCR
                2.1.4 纯化、连接与转化
                2.1.5 克隆质粒的筛选
            2.2 携带PRRSV N、Nsp2 基因原核表达载体的构建
                2.2.1 目的基因PCR
                2.2.2 纯化、酶切、连接与转化
                2.2.3 原核表达质粒的筛选
            2.3 重组蛋白的原核表达与条件优化
                2.3.1 重组蛋白的原核表达
                2.3.2 诱导条件优化
                2.3.3 重组蛋白的纯化与鉴定
            2.4 高免血清制备
                2.4.1 重组蛋白浓度的测定
                2.4.2 动物免疫与血清收集
                2.4.3 高免血清效价测定
                2.4.4 高免血清Western blotting鉴定
        3 结果
            3.1 携带PRRSV N、NSP2 基因克隆载体的构建结果
                3.1.1 目的基因PCR结果
                3.1.2 克隆质粒的筛选结果
            3.2 携带PRRSV N、NSP2 基因原核表达载体的构建结果
                3.2.1 原核表达质粒筛选结果
                3.2.2 原核表达质粒双酶切结果
            3.3 重组蛋白的原核表达与条件优化结果
                3.3.1 重组蛋白的原核表达结果
                3.3.2 诱导条件优化结果
                3.3.3 重组蛋白的纯化与鉴定
            3.4 高免血清制备结果
                3.4.1 高免血清效价测定结果
                3.4.2 高免血清Western blotting鉴定结果
        4 讨论
    第二章 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白单克隆抗体的制备
        1 材料
            1.1 主要实验动物、细胞和毒株
            1.2 主要试剂
        2 方法
            2.1 单克隆抗体ELISA检测方法的建立
            2.2 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白单克隆抗体的制备
                2.2.1 动物免疫
                2.2.2 细胞培养
                2.2.3 细胞融合
                2.2.4 杂交瘤细胞的筛选
            2.3 单克隆抗体的鉴定
                Western blotting鉴定
            2.4 单克隆抗体腹水的制备
            2.5 单克隆抗体稳定性的鉴定
            2.6 单克隆抗体的应用
                2.6.1 Western blotting鉴定
                2.6.2 IFA鉴定
        3 结果
            3.1 单克隆抗体ELISA检测方法建立结果
            3.2 PRRSV BJ3 毒株N和 Nsp2 蛋白单克隆抗体的制备
                3.2.1 细胞融合结果
                3.2.2 杂交瘤细胞的筛选结果
            3.3 单克隆抗体的鉴定结果
                Western blotting鉴定结果
            3.4 单克隆抗体腹水效价结果
            3.5 单克隆抗体稳定性鉴定结果
            3.6 单克隆抗体应用结果
                3.6.1 Western blotting鉴定结果
                3.6.2 IFA鉴定结果
        4 讨论
全文结论
参考文献
附录一 相关培养基、溶液及试剂的配制
附录二 硕士研究生期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3817248