利用农杆菌突变体快速获得Cas9-free水稻植株的方法探索

发布时间：2023-12-10 16:43

　　水稻是世界上重要的粮食作物,也是单子叶模式植物。水稻基因功能的研究对提高水稻的产量和品质具有重要意义。CRISPR/Cas9技术是一种非常重要的基因编辑技术,可以实现基因的定点编辑,它在作物遗传改良和基因功能研究中有着重要作用。目前,CRISPR/Cas9技术在水稻中的应用非常普遍,许多实验室通过CRISPR/Cas9介导的方法对水稻中的基因进行了精确编辑。然而,大多数技术会将来自农杆菌的T-DNA整合到植物基因组中,这会导致可遗传的外源DNA元件转化到宿主植物中。在这个课题中,我们研究了一种有潜力的用于快速获得Cas9-free水稻植株的方法。我们回顾农杆菌相关文献发现,农杆菌的毒蛋白基因VirD2的ω域介导外源DNA整合到植物基因组,而VirD5基因的缺失影响农杆菌的稳定转化,但不影响其瞬时转化。因此,我们去除了农杆菌EHA105的VirD2基因的ω结构域,然后,与VirD5基因缺失的农杆菌菌株一起介导水稻转化,使用了3种测试方案获得Cas9-free的突变水稻植株。方案一中,我们在水稻组培的抗性筛选过程中分了3种情况进行实验:第一种是两次筛选时都加入潮霉素处理,第二种是第一次筛选...

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 前言
    1.1 研究问题的由来
    1.2 文献综述
        1.2.1 CRISPR/Cas9系统
            1.2.1.1 CRISPR/Cas9系统的起源
            1.2.1.2 CRISPR/Cas系统的作用机制
            1.2.1.3 CRISPR/Cas9技术在研究与育种中的应用
            1.2.1.4 Cas9-free研究进展
            1.2.1.5 基因编辑作物的商业应用
        1.2.2 根癌农杆菌
            1.2.2.1 根癌农杆菌的Ti质粒
            1.2.2.2 农杆菌介导的高瞬时转化效率
            1.2.2.3 根癌农杆菌毒力蛋白VirD2与VirD5的研究进展
    1.3 研究目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和载体
    2.2 实验方法
        2.2.1 构建重组质粒pJQ-mVirD2
        2.2.2 根癌农杆菌VirD2缺失突变体的筛选
        2.2.3 农杆菌突变体电转化感受态的制备
        2.2.4 CRISPR质粒转入农杆菌
        2.2.5 农杆菌介导的粳稻转化
        2.2.6 突变体转基因阳性检测
            2.2.6.1 水稻总DNA抽提
            2.2.6.2 转基因阳性检测
        2.2.7 突变体基因型检测
3 结果与分析
    3.1 构建重组质粒pJQ-mVirD2
        3.1.1 目的基因的扩增
        3.1.2 载体pJQ200SK的酶切
        3.1.3 载体的连接和转化
        3.1.4 菌液PCR检测
        3.1.5 测序
    3.2 根癌农杆菌VirD2缺失突变体的筛选
        3.2.1 抗性筛选
        3.2.2 蔗糖筛选
    3.3 方案一结果分析
        3.3.1 方案一CRISPR质粒转入农杆菌
        3.3.2 方案一水稻组培实验
        3.3.3 方案一转基因T0代水稻植株鉴定分析
    3.4 方案二结果分析
        3.4.1 方案二CRISPR质粒转入农杆菌
        3.4.2 方案二水稻组培实验
        3.4.3 方案二转基因T0代水稻植株鉴定分析
    3.5 方案三结果分析
        3.5.1 方案三CRISPR质粒转入农杆菌
        3.5.2 方案三水稻组培实验
        3.5.3 方案三转基因T0代水稻植株鉴定分析
4 讨论
参考文献
附录
致谢



本文编号：3872742