甲型流感病毒的拯救及NS1与NOLC1蛋白的相互作用对其感染的影响

发布时间：2023-12-11 18:56

　　甲型流感病毒作为主要的病源,每年都会引起不同规模的流感疫情。NS1蛋白是甲型流感病毒主要的毒性蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用。实验室在前期已经证明甲型流感病毒NS1蛋白与宿主细胞NOLC1蛋白存在特异性的相互作用,并确定了两种蛋白的特异性位点,然而对于NS1与NOLC1蛋白相互作用相关机制与影响尚不清楚。本文利用感染性克隆技术构建了H1N1(PR8)野生型(WT)病毒的八质粒系统,并根据H1N1的NS1蛋白与NOLC1蛋白的序列特异性作用位点(125D与200R)构建了三套突变型H1N1型病毒的感染性克隆转录系统。深入研究了NS1蛋白与NOLC1相互作用对流感病毒H1N1复制的影响。主要工作如下:1、通过构建H1N1甲型禽流感病毒关于感染性克隆的PHW2000双转录八质粒系统与NS1突变的三套系统,成功拯救并获得了四种流感病毒毒株:H1N1(WT)、H1N1-125、H1N1-200、H1N1-125/200;同时构建并筛选出A549的NOLC1蛋白敲降稳转细胞株(pLKO.1-TRC-NOLC1);检测出鸡胚扩增的流感病毒H1N1(PR8)的病毒滴度TCID50/mL在5.6...

【文章页数】：87 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 甲型流感病毒
        1.1.1 背景
        1.1.2 甲型流感病毒的病毒学特点
        1.1.3 甲型流感病毒NS1蛋白简介
        1.1.4 甲型流感病毒在宿主细胞中的复制
    1.2 人核仁磷酸化NOLC1蛋白简介
    1.3 RNA干扰技术
        1.3.1 RNAi背景
        1.3.2 RNA干扰技术机制
    1.4 实验研究目的及意义
第二章 H1N1甲型流感病毒八质粒系统的建立
    2.1 前言
    2.2 材料与试剂
        2.2.1 主要材料
        2.2.2 主要试剂
    2.3 溶液配制
    2.4 仪器和耗材
    2.5 实验方法
        2.5.1 PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS1 双转录八质粒系统构建
        2.5.2 NS1-125、NS1-200 两单点与NS1-125/200 双点NS1 突变三质粒构建
    2.6 实验结果与讨论
第三章 H1N1甲型流感病毒的拯救与验证
    3.1 前言
    3.2 材料与试剂
        3.2.1 实验准备
        3.2.2 主要试剂
    3.3 溶液配制
    3.4 仪器和耗材
    3.5 实验方法
        3.5.1 239T与MDCK细胞复苏
        3.5.2 239T与MDCK细胞的培养与传代
        3.5.3 用Lipofectamine?3000 进行八质粒转染
        3.5.4 SPF鸡胚接种
        3.5.5 收集鸡胚尿囊液的扩增的病毒样品
        3.5.6 HA血凝初步检测验证
        3.5.7 病毒滴度TCID50测定
        3.5.8 拯救病毒对A549细胞感染的病变(CPE)检测
        3.5.9 绝对定量法(RT)检测获得拯救病毒的拷贝数
    3.6 实验结果与讨论
        3.6.1 HA血凝初步检测验证
        3.6.2 病毒滴度TCID50测定结果
        3.6.3 病毒感染A549细胞的病变(CPE)检测结果
        3.6.4 绝对定量法(RT)检测获得拯救病毒的拷贝数结果
        3.6.5 综合结果讨论
第四章 A549细胞株NOLC1蛋白的敲降慢病毒系统构建
    4.1 前言
    4.2 材料与试剂
        4.2.1 试材准备
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 溶液配制
        4.2.4 仪器及耗材
    4.3 实验方法
        4.3.1 慢病毒干扰载体p LKO.1-TRC--NOLC1
        4.3.2 嘌呤霉素工作浓度的确定
        4.3.3 慢病毒包装以及稳转株筛选
        4.3.4 WB检测A549 细胞及其敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量
    4.4 实验结果
        4.4.1 嘌呤霉素工作浓度的确定
        4.4.2 WB检测A549 及其敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量
    4.5 结果讨论
第五章 H1N1 甲型流感病毒感染A549对NOLC1 的影响
    5.1 前言
    5.2 材料与试剂
        5.2.1 试材准备
        5.2.2 主要试剂
        5.2.3 溶液配制
        5.2.4 仪器和材料
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞培养
        5.3.2 WT、125、200、125/200四种病毒感染与样品收集
        5.3.3 细胞样品总RNA提取
        5.3.4 一步法反转录
        5.3.5 RT-PCR荧光定量检测NOLC1 基因转录
        5.3.6 Western Blot技术检测正常A549中NOLC1 蛋白含量
    5.4 实验结果
        5.4.1 野生型病毒感染A549细胞NOLC1蛋白含量的变化情况
        5.4.2 四种病毒感染A549细胞对NOLC1蛋白的影响比较
        5.4.3 病毒感染A549细胞时间点NOLC1基因转录水平
    5.5 结果讨论
第六章 NS1与NOLC1 蛋白的相互作用对HIN1 病毒复制的影响
    6.1 前言
    6.2 材料与试剂
        6.2.1 试材准备
        6.2.2 主要试剂
        6.2.3 溶液配制
        6.2.4 仪器和材料
    6.3 实验方法
        6.3.1 细胞培养
        6.3.2 WT、125、200、125/200四种病毒感染与样品收集
        6.3.3 样品总RNA提取
        6.3.4 两步法逆转录与RTPCR检测样品
        6.3.5 RT-PCR荧光定量检测病毒总RNA、v RNA、c RNA
    6.4 实验结果
        6.4.1 四种病毒感染后时间点内病毒RNA的拷贝数
        6.4.2 四种病毒感染后时间点内病毒vRNA的拷贝数
        6.4.3 四种病毒感染后时间点内病毒cRNA的拷贝数
        6.4.4 四种病毒感染后时间点内病毒滴度变化
    6.5 结果讨论
第七章 结论与展望
致谢
参考文献
研究生期间发表的论文及参加科研情况
附录一 SPF鸡胚检测报告
附录二 试剂及配置一览表一
附录三 试剂及配置一览表二
附录四 主要仪器与耗材一览表
附录五 主要实验结果图一览表



本文编号：3873170