重组猪胰蛋白酶原及其突变体在毕赤酵母X33中的组成型表达
发布时间:2024-03-01 21:59
目的:设计以PGAP为启动子的组成型质粒,构建高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得重组猪胰蛋白酶。方法:首先将质粒转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,电转化至毕赤酵母X33,表达重组猪胰蛋白酶原,经肠激酶激活,纯化提取得到重组猪胰蛋白酶。结果:筛选到高效表达重组猪胰蛋白酶原的毕赤酵母X33菌株,获得了重组猪胰蛋白酶。结论:以PGAP为启动子的质粒,转化毕赤酵母X33后表达的重组猪胰蛋白酶原避免了补加甲醇带来的危害,且操作方便,大大缩短了周期,提高了生产效率,避免了动物源性污染。
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【部分图文】:
本文编号:3915885
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图1X33/pGAP-PT表达上清的SDS-PAGE
突变体在胰岛素原酶切实验中胰岛素得率较高,因此,我们研究了使用PGAP、PGAP1、PGAP2、PGAP3和PGAP4启动子的突变体的胰蛋白酶原表达情况。不同启动子突变体的表达上清SDS-PAGE显示有目的蛋白表达,且X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP4-PT1表达....
图3X33/pGAP-PT与X33/pGAP-PT1上清SDS-PAGE对比M:蛋白marker;1:X33/pGAP-PT;2:X33/pGAP-PT1
将X33/pGAP1-PT1进行5L发酵,离心取上清,对表达上清的胰蛋白酶原进行捕获、激活和纯化,从色谱图(图6)可以看到,通过苯甲醚亲和层析得到了纯度较高的胰蛋白酶,测得浓度为0.94mg/mL,比活6365U/mg,活性5983U/mL。图4X33不同启动子表....
图2X33/pGAP-PT1表达上清的SDS-PAGE
图1X33/pGAP-PT表达上清的SDS-PAGE2.3活性测定
图8X33/pGAP1-PT1的LC-MS图
图7胰蛋白酶的HPLC图3讨论
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