卤醇脱卤酶红外及荧光探针标记及其结构动力学研究初探

发布时间：2024-03-09 09:50

　　卤醇脱卤酶不仅能够降解环境中存在的有机卤化物,还能合成具有手性的环氧化物和β-取代醇,其催化机理和广泛的应用前景近年来备受关注。卤醇脱卤酶的动态结构变化与其生物功能紧密相连,是卤醇脱卤酶发挥功能的重要结构基础,对其结构动力学的研究有助于揭示卤醇脱卤酶的催化反应机理,以及提升酶的改造效率。众所周知,光谱技术在研究酶蛋白结构的动态性方面具有广泛应用,相关研究需要在酶蛋白中嵌入合适的光谱探针,因此探针对酶蛋白的标记就显得尤为重要。本研究结合了生物学技术和光谱技术,将红外、荧光探针位点特异性的嵌入卤醇脱卤酶中,探针标记卤醇脱卤酶的位点不受局限,对所处的微环境非常敏感,且能精准地反映出酶蛋白动态结构的微小变化,在蛋白质结构动力学研究中具有显著优势。本研究应用密码子扩展法将非天然氨基酸Naek引入HheC的K140,K161,P184三个位点,通过优化表达体系和亲和层析得到了叠氮基团修饰的酶蛋白,并进行了酶催化特性及红外光谱检测。实验结果表明:(1)184⁺突变体的酶活最佳,并且具有与野生型相当的热稳定性、最适反应温度;(2)由于探针所处微环境的极性不同,K140,K161,...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-2卤醇脱卤酶的脱卤反应流程

通过开环反应合成环氧化合物及释放过程中，卤醇脱卤酶活性位点的构构象变化的结构基础和机制，也能进一的脱卤机制遵循三步动力学步骤：米氏卤醇脱卤酶催化PNSHH的脱卤反应过速步骤。图1-1卤醇脱卤酶的脱卤反应流程[6]生成，速率常数Ks；第二步：可逆反应，常数k3，此步为限....

图1-3修饰Cys和Lys残基的生物共轭反应[29]

辨率地实时监测单细胞中的酶动力学。作者使用该方法检测了小鼠模胞中NAD（P）H与酶的实时动力学，观察到复合I位点的线粒体呼是通过游离和蛋白质结合的重新分布介导的。光谱技术在研究蛋白质的结构动力学具有诸多优势，探针能灵敏地反环境的信息以及蛋白质结构的变化。因此，在保证蛋白质....

图1-4体外将UAA位点特异性嵌入蛋白质中[33]

46]，振动光谱[47-49]等方法观察其独特的光谱特征。和叠氮化物可以说是UAA最重要的两个功能基团，因为它们在IR检稳定，具有比较好的光谱灵敏度和吸收值[50,51]。叠氮化物作为非天然氨较大的优越性，因为叠氮化合物具有更大的消光系数，同时在频率变化对其局部环境的高....

图1-7光催化环加成反应(Photoclickreaction)

图1-5叠氮-炔基环加成反应（SPAAC）[74]他类型的点击化学反应化的Huisgen1,3-偶极环加成[81]将两种不饱和的反应物结合各种五元杂环[82]，反应过程如图1-6所示。该反应实现了涉共轭反应（每步产率>99.8％）[83]，并已用于基于活性的蛋[84]....

本文编号：3923244