转座酶Tn3体外定向进化和酶活力提高方法的建立

发布时间：2024-05-21 00:45

　　试验旨在对转座酶Tn3的酶活力提高和进化进行初步探索。采用PCR扩增、限制性酶切、DNA连接、重组质粒的转化、易错PCR的优化及构建、D值的测定、酶切鉴定方法对转座酶Tn3进行体外定向进化研究。结果表明,用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行酶切,得到了450 bp的酶切产物;在含有卡那霉素的LB培养基培养菌体24 h,测量其D值,经过3轮重复性的研究,其D值和增殖能力从开始的0上升至0.18、0.42、0.60,说明Tn3活性有了明显的提高;将筛选得到的进化型重组质粒进行质粒抽提,用内切酶XhoⅠ和XbaⅠ进行双酶切鉴定,发现进化型重组质粒酶切产物条带相对较小;之后对进化型重组质粒进行基因测序分析,发现Tn3基因序列的多个位点发生了突变以及Tn3-Gal4靶向序列中间的CCR5-delta32基因被切除。说明成功完成了转座酶Tn3基因的克隆;确立了易错PCR的最优反应体系;选择卡那霉素作为筛选标记对进化型Tn3进行筛选,初步验证利用含有卡那霉素的LB培养基和对菌液D值的测定来进行筛选是可行的;Tn3基因序列突变和基因敲除,说明不论是在功能上还是在基因序列上Tn3都发生了改变,这种变化正是...

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【部分图文】：

图3不同MnCl2浓度下易错PCR扩增结果

图2不同MgCl2浓度下易错PCR扩增结果2.3目的基因的筛选及鉴定

图1重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳

将Tn3基因与克隆载体连接,用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒进行酶切,并进行琼脂糖凝胶电泳(图1)。酶切结果显示,在450bp处出现了酶切产物,与之前进行质粒重组时所连接的片段大小一致。由此可以初步判定已成功地完成了Tn3基因的克隆。2.2易错PCR体系的优化及构建

图2不同MgCl2浓度下易错PCR扩增结果

考察Mn2+浓度,结果显示不同浓度MnCl2在450bp处都出现目的条带,相比之下只有MnCl2浓度为0.5mmol/L的条带亮度较深,因此0.5mmol/L的MnCl2为Tn3易错PCR反应体系的最佳浓度(图3)。经过对不同MgCl2和MnCl2浓度的考察,得到易错PCR....

图4三轮菌液不同时间D600nm值曲线图

由图5可知,与原始重组质粒相比,进化型重组质粒酶切产物条带较小。因此可以初步判断,进化型Tn3-Gal4已将目的基因片段CCR5-delta32靶向切除。图5筛选菌株酶切产物琼脂糖凝胶电泳

本文编号：3979361