兼具GPx和SOD活性双功能抗氧化酶的原核表达与表征
发布时间：2024-05-21 20:40
谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)是机体抗氧化酶学防线的重要成员,已经有大量的研究证明了它们的重要作用。GPx和SOD相互协同清除多种活性氧(ROS)以保护机体免受氧化损伤,同时它们还能组成相互保护的防御体系,这种协同作用是机体正常代谢必不可少的,如果这种协同作用被破坏,可将ROS的损伤效应放大。基于两者的协同作用,获取含有GPx和SOD活性双功能抗氧化酶,相比于单功能抗氧化酶具有更高的应用价值。同时天然酶存在着稳定性差、来源少的缺点,极大限制了它们的应用,因此如何获得具有高活力、高稳定性的双功能抗氧化酶成为了我们的目标,基于这个目标,我们开展了以下研究工作:1.基于h GPx1与Ap SOD的双功能抗氧化酶的表达与表征联合使用半胱氨酸缺陷型表达系统和单一蛋白表达系统(SPP),在人GPx1突变基因(h GPx1Ser)和庞贝蠕虫SOD基因(Ap SOD)的基础上设计构建了多种兼具GPx和SOD活性的双功能融合蛋白,对活力最高的Se-h GPx1Ser-L-Ap SOD的酶学性质进行了研究,并验证了该融合蛋白的协同作用。2.基于h GPx1与Ap SOD的双功能抗氧...
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
提要
中文摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 绪论
1.1 活性氧
1.1.1 活性氧概述
1.1.2 ROS的来源
1.1.3 氧化应激
1.1.4 ROS与人类疾病
1.1.5 ROS的控制
1.2 谷胱甘肽过氧化物酶
1.2.1 GPx概述
1.2.2 GPx分类
1.2.3 GPx的结构
1.2.4 含硒GPx催化机制
1.3 硒与硒蛋白
1.3.1 硒的概述
1.3.2 Sec的合成
1.3.3 Sec的插入机制
1.3.4 人工硒蛋白的获得方法
1.4 超氧化物歧化酶
1.4.1 SOD概述
1.4.2 SOD与人类健康
1.4.3 SOD结构
1.4.4 SOD的催化机制
1.5 兼具多功能酶活性的人工酶
1.6 立题依据及研究策略
第二章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征
2.1 序言
2.2 实验部分
2.2.1 实验试剂
2.2.2 实验仪器
2.2.3 菌株与质粒
2.2.4 试剂配方
2.2.5 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 ApSOD全基因合成
2.3.2 基因的调取
2.3.3 构建表达质粒及鉴定
2.3.4 非含硒融合蛋白的表达及纯化
2.3.5 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化
2.3.6 蛋白活力测定
2.3.7 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的计算机结构模拟分析
2.3.8 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的最适温度及p H测定
2.3.9 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的稳定性研究
2.3.10 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的GPx稳态动力学研究
2.3.11 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的ESI-MS检测
2.3.12 抗过氧化氢失活实验
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的活力改善
3.1 序言
3.2 实验部分
3.2.1 实验试剂
3.2.2 实验仪器
3.2.3 菌株与质粒
3.2.4 试剂配方
3.2.5 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 pCold-hGPx1Ser-lL-ApSOD和pRSF-hGPx1UAG-lL-ApSOD重组质粒的构建
3.3.2 pCold-hGPx1-lL-ApSOD(C/S)突变质粒的构建
3.3.3 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定
3.3.4 蛋白活力的测定
3.3.5 融合蛋白的计算机结构模拟分析
3.3.6 Se-hGPx1UAG-lL-ApSOD的性质表征
3.3.7 Se-hGPx1Ser-lL-ApSOD及Se-hGPx1UAG-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究
3.3.8 ESI-MS检测Se-GPx1UAG-lL-ApSOD的精确分子量测定
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于hGPx2与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征
4.1 序言
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验仪器
4.2.3 质粒与菌株
4.2.4 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 基因的调取
4.3.2 双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定
4.3.3 蛋白活力测定
4.3.4 Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的酶学性质研究
4.3.5 Se-hGPx2Ser-lL-ApSOD和Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的稳定性研究
4.3.6 Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究
4.3.7 双功能融合蛋白的计算机结构模拟分析
4.3.8 抗过氧化氢失活实验
4.4 讨论
4.5 本章小结
结语与创新点
参考文献
作者简介及攻读学位期间取得的成绩
攻读学位期间取得的成果
致谢
本文编号：3979892
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
提要
中文摘要
Abstract
英文缩写词表
第一章 绪论
1.1 活性氧
1.1.1 活性氧概述
1.1.2 ROS的来源
1.1.3 氧化应激
1.1.4 ROS与人类疾病
1.1.5 ROS的控制
1.2 谷胱甘肽过氧化物酶
1.2.1 GPx概述
1.2.2 GPx分类
1.2.3 GPx的结构
1.2.4 含硒GPx催化机制
1.3 硒与硒蛋白
1.3.1 硒的概述
1.3.2 Sec的合成
1.3.3 Sec的插入机制
1.3.4 人工硒蛋白的获得方法
1.4 超氧化物歧化酶
1.4.1 SOD概述
1.4.2 SOD与人类健康
1.4.3 SOD结构
1.4.4 SOD的催化机制
1.5 兼具多功能酶活性的人工酶
1.6 立题依据及研究策略
第二章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征
2.1 序言
2.2 实验部分
2.2.1 实验试剂
2.2.2 实验仪器
2.2.3 菌株与质粒
2.2.4 试剂配方
2.2.5 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 ApSOD全基因合成
2.3.2 基因的调取
2.3.3 构建表达质粒及鉴定
2.3.4 非含硒融合蛋白的表达及纯化
2.3.5 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化
2.3.6 蛋白活力测定
2.3.7 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的计算机结构模拟分析
2.3.8 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的最适温度及p H测定
2.3.9 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的稳定性研究
2.3.10 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的GPx稳态动力学研究
2.3.11 Se-hGPx1Ser-L-ApSOD的ESI-MS检测
2.3.12 抗过氧化氢失活实验
2.4 讨论
2.5 本章小结
第三章 基于hGPx1与ApSOD的双功能抗氧化酶的活力改善
3.1 序言
3.2 实验部分
3.2.1 实验试剂
3.2.2 实验仪器
3.2.3 菌株与质粒
3.2.4 试剂配方
3.2.5 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 pCold-hGPx1Ser-lL-ApSOD和pRSF-hGPx1UAG-lL-ApSOD重组质粒的构建
3.3.2 pCold-hGPx1-lL-ApSOD(C/S)突变质粒的构建
3.3.3 含硒双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定
3.3.4 蛋白活力的测定
3.3.5 融合蛋白的计算机结构模拟分析
3.3.6 Se-hGPx1UAG-lL-ApSOD的性质表征
3.3.7 Se-hGPx1Ser-lL-ApSOD及Se-hGPx1UAG-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究
3.3.8 ESI-MS检测Se-GPx1UAG-lL-ApSOD的精确分子量测定
3.4 讨论
3.5 本章小结
第四章 基于hGPx2与ApSOD的双功能抗氧化酶的表达与表征
4.1 序言
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验仪器
4.2.3 质粒与菌株
4.2.4 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 基因的调取
4.3.2 双功能融合蛋白的表达及纯化鉴定
4.3.3 蛋白活力测定
4.3.4 Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的酶学性质研究
4.3.5 Se-hGPx2Ser-lL-ApSOD和Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的稳定性研究
4.3.6 Se-hGPx2UAG-lL-ApSOD的GPx稳态动力学研究
4.3.7 双功能融合蛋白的计算机结构模拟分析
4.3.8 抗过氧化氢失活实验
4.4 讨论
4.5 本章小结
结语与创新点
参考文献
作者简介及攻读学位期间取得的成绩
攻读学位期间取得的成果
致谢
本文编号：3979892
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3979892.html
教材专著
