长非编码RNA Gtl2在小鼠早期胚胎中调控转录因子Oct4的分子机制

发布时间：2024-11-30 23:14

　　Gtl2基因位于小鼠12号染色体末端的Dlk1-Dio3印记区间,其转录的长非编码RNA Gtl2对胚胎发育和肿瘤发生都具有重要功能。本实验室前期对小鼠早期胚胎的研究发现,Gtl2于桑葚胚期开始表达,并最终特异性定位于囊胚内细胞团(ICM)。功能研究表明,干扰Gtl2的表达虽然不影响囊胚发育率,但会影响囊胚的孵化(hatching)、体外生长(outgrowth)和内细胞团(ICM)的形成。进一步研究发现,Gtl2的表达下调导致囊胚ICM特异性转录因子Oct4的表达下降,提示Gtl2很可能通过影响Oct4而发挥作用。前期实验已经证实,Gtl2可能作为ceRNA(competing endogenous RNA)通过miRNA途径调控Oct4的表达,从而在早期胚胎中发挥作用。因此,本课题旨在筛选可能与Gtl2结合并调控Oct4的候选miRNA,并揭示Gtl2在小鼠早期胚胎中调控Oct4可能的分子机制。首先,利用生物信息学网站工具并结合已发表的论文,我们筛选出既能与Gtl2有潜在结合能力又被实验证实可以下调Oct4的候选miRNAs:let-7c(2个结合位点)、miR-24、miR-29a...

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摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 长非编码RNA
        1.1.1 长非编码RNA分类
        1.1.2 LncRNA的作用
        1.1.3 LncRNA与早期胚胎
    1.2 长非编码RNA Gtl2 的研究进展
        1.2.1 Dlk1-Dio3 印记区间
        1.2.2 Gtl2(Meg3)在肿瘤中的相关研究
        1.2.3 Gtl2 在着床后胚胎中的相关研究
    1.3 研究意义和主要研究内容
        1.3.1 本课题的研究意义
        1.3.2 本课题的主要研究内容
        1.3.3 技术路线
第2章 实验材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物、菌株、细胞系及载体
        2.1.2 实验试剂、试剂盒
        2.1.3 实验仪器、常用网站、软件、引物、测序
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组载体的构建
        2.2.2 突变载体的构建
        2.2.3 细胞的培养和转染
        2.2.4 双荧光素酶报告系统实验
        2.2.5 细胞总RNA的提取
        2.2.6 RNA的反转录和定量PCR
        2.2.7 体外转录
        2.2.8 用于显微注射的受精卵的获取
        2.2.9 显微注射和胚胎的体外培养
        2.2.11 胚胎的体外生长(outgrowth)实验
第3章 筛选结合Gtl2 并靶向调控Oct4的miRNA
    3.1 引言
    3.2 生物信息学预测与Gtl2 结合并靶向调控Oct4的miRNA
    3.3 构建双荧光素酶报告系统的pMIR-report重组载体
    3.4 构建双荧光素酶报告系统的pMIR-report突变载体
    3.5 构建双荧光素酶报告系统鉴定miRNA与 Gtl2 发生相互作用
    3.6 讨论
    3.7 本章小结
第四章 Gtl2 在细胞水平与候选miRNA相互作用研究
    4.1 引言
    4.2 MLTC-1 细胞中验证miRNA与内源性Gtl2 的相互作用
    4.3 N2a细胞中验证let-7c与内源性Gtl2 的相互作用
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 Gtl2 在胚胎水平中通过候选miRNA途径发挥作用研究
    5.1 引言
    5.2 Gtl2 转录本的扩增
    5.3 .胚胎中挽救实验验证miRNA与 Gtl2 发生相互作用
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
结论
参考文献
附录一
附录二
附录三
附录四
致谢



本文编号：4013166