细胞膜锚定DNA四面体传感器实时监测外泌体的分泌

发布时间：2025-02-05 18:12

　　 外泌体是细胞主动分泌的一种纳米级双层膜结构的小囊泡,能够直接反映分泌细胞的生理和功能状态,进行细胞间的物质运输和信息通讯,并参与多种生理及病理过程.本文针对细胞分泌外泌体的动态过程,以DNA四面体为基础,结合细胞膜修饰技术和荧光成像技术,构建了一种易操作、高稳定性的细胞膜表面DNA四面体传感器,应用于不同细胞类型分泌外泌体的实时监测. DNA四面体传感器通过脚支链与疏水性胆固醇探针的杂交互补作用锚定于细胞膜表面,利用四跨膜蛋白CD63核酸适配体序列特异性捕获细胞膜表面释放的外泌体,通过监测细胞膜表面荧光的变化,实时测定外泌体的分泌情况.

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【部分图文】：

图1 DNA四面体传感器的锚定及实时监测外泌体分泌的工作原理示意图

本文以DNA四面体为基础,结合细胞膜疏水性修饰技术和荧光成像技术,构建了一种细胞膜表面DNA四面体传感器,应用于不同细胞类型分泌外泌体的实时监测.如图1所示,胆固醇修饰的锚定探针(AP)首先通过疏水作用固定于细胞膜表面,DNA四面体传感器通过25bp延伸脚趾与AP结合固定于细胞....

图2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)验证TDN-F的形成.M:8000 bp DNA Ladder Marker;泳道1:A-F;泳道2:B-S+C-S;泳道3:B-S+C-S+D-S;泳道4:TDN-F;泳道5:TDN-F+QP;泳道6:TDN-F+QP+BP(传感器).

采用边长为17bp的DNA四面体来构建传感器.合成DNA四面体结构(TDN-F)的四条链(A-F,B-S,C-S,D-S),QP和BP通过自组装形成传感器(Sensor),利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对传感器进行表征.如图2所示,随着A-F到BP的添加,DNA混合物的凝胶迁移率....

图3 (A) TDN-F在细胞膜表面锚定的示意图及显微镜成像;(B) RP置换TDN-F延伸脚趾示意图;(C) TDN-F固定化验证的显微镜成像

以HepG2细胞作为模型细胞,研究传感器的固定化及外泌体捕获的可行性.通过共聚焦激光扫描显微镜验证传感器固定化的可行性,如图3A所示,过夜培养的细胞与1μmol/LAP在37℃下孵育20min,与0.3μmol/LTDN-F孵育1h后,荧光均匀分布于细胞膜表面,表明TD....

图4 (A)缓冲液中探针的功能验证;(B)缓冲液中传感器对外泌体的响应情况

通过荧光光谱法,共聚焦显微镜成像和流式细胞仪分析验证传感器捕获外泌体的可行性.首先,在缓冲溶液中评估探针的功能性及传感器对外泌体的响应情况.如图4A所示,TDN-F+QP+Exo中荧光信号恢复(绿色曲线),表明外泌体蛋白成功与适配子结合，将QP从传感器上置换释放;TDN-F+QP....

本文编号：4030243