阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

发布时间：2025-02-05 13:42

　　 [背景]阿维菌素起始酰基转移酶（AveAT₀）能够以2-甲基丁酰-辅酶A （coenzyme A,CoA）和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT₀对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶（loading acyltransferases,AT₀s）进行序列比对,找到AveAT₀底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨（N-acetylcysteamine,SNAC）和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基（sulfhydryl,SH）,测定AveAT₀及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT₀及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT₀对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,k_c...

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【部分图文】：

图1 阿维菌素PKS起始模块的AT

在许多大环内酯类抗生素的生物合成过程中，AT0充当“守门人”的作用，识别幵且加载起始单元启动聚酮化合物的合成[9]。有些聚酮合酶的起始模块与阿维菌素的类似，只含有AT0和ACP0，有学者将其称为AVE型AT0[4]。与AVE型AT0不同，超过半数的PKS起始模块都含有一个类似于K....

图3 AVE型AT0与KSQ型AT0的系统发育树

为了检测定点突变对AveAT0水解活性的影响，以MB-SNAC和IB-SNAC为底物，在酶浓度己知的情冴下，通过特定的底物浓度(2mmol/L)测得AveAT0及各个突变体对MB-SNAC和IB-SNAC的v/E0。从图5中可以看出，各个突变体对MB-SNAC和IB-SNAC的....

图4 Ave AT0 SDS-PAGE电泳(A)和FPLC分析(B)

图3AVE型AT0与KSQ型AT0的系统发育树图5AveAT0及突变体的水解活性

图5 AveAT0及突变体的水解活性

图4AveAT0SDS-PAGE电泳(A)和FPLC分析(B)2.4酶动力学参数

本文编号：4029924