稳定表达抗HER2单克隆抗体的FUT8基因敲除细胞株的建立

发布时间：2025-04-11 02:59

　　 本研究在实验室前期构建的敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株(FUT8-/--CHO-S)基础上,建立了稳定表达IgG1型抗HER2单克隆抗体的稳转细胞株。以曲妥珠单抗为模式蛋白,构建了带有嘌呤霉素抗性基因的表达载体pIRES-HC和pIRES-LC,并用电穿孔法共转染入FUT8-/--CHO-S细胞,通过嘌呤霉素加压培养、Dot Blot和WesternBlot等检测方法,经过两轮有限稀释筛选出了高表达的稳转细胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。该细胞株在批次培养(Batch)中最高生长密度达每毫升6.05×106个,抗体产量为168 mg/L。在补料培养(Fed-Batch)中,通过补料CHO Feed4的添加,最高生长密度提高到每毫升17.1×106个,抗体产量达到437 mg/L,试验结果表明改造的FUT8-/--CHO-S细胞株具有开发成工业细胞株的潜力。

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【部分图文】：

图2M-Marker；1-转染细胞上清；2-曲妥珠单抗(阳性对照，25ng/μl)；3-未转染细胞上清(阴性对照)

stableandhighexpressioncellclonehigherproductionbyapplyingaFed-Batchstrategyα-1,6-fucosyltransferase(FUT8)geneknockoutCHO-Scellsclonalcellis....

图3检测(阳性对照-曲妥珠单抗，上样量2μl)，B：挑选的单克隆细胞抗体表达的WesternBlot检测M-Marker；1-曲妥珠单抗(25ng/μl)；2～37-36株单克隆细

养，取等量细胞上清用WesternBlot进一步检测蛋白表达情况(图3B)，筛选出高表达的初始细胞株后，用有限稀释法进行第二轮筛眩重复上述筛选步骤，并对得到的高表达亚克隆细胞进行悬浮驯化培养，得到最终的稳转细胞株Tru-FUT8-/--CHO-S。阳性对照阳性对照M1234567....

图4A：细胞生长曲线(n=3)，B：细胞上清ProteinA纯化的SDS-PAGE检测M-Marker；1-细胞上清；2-流穿液；3、4、6-洗脱得到的蛋白样品；5-曲妥珠单抗

－补料EfficientFeedA；○－补roporationsfectionselectionwithpuromycin3weekswithnA8060402010080604020012345678细胞活率/%活细胞密度/×10个5-活细胞密度；-细胞活率培养时间/d非还原还....

本文编号：4039397