VEGF、p53在精原细胞瘤中的表达及相关性分析

　　精原细胞瘤起源于原始生殖细胞，是睾丸最常见的恶性肿瘤，约占30％ ～40％ ，好发年龄为35～45岁? 。早期精原细胞瘤手术简单，术后辅助以放疗和化疗，90％ 能痊愈，晚期发现则疗效差，死亡率高。因此早期发现精原细胞瘤对提高患者的生存率、治愈率起着极其关键的作用。目前许多学者开始关注基因表达学方法来早期诊断精原细胞瘤，并研究精原细胞瘤相关基因的结构功能、表达与突变以及多基因之间的相互联系，对于揭示精原细胞瘤发生发展的分子机制，探索临床早期诊断的分子标记和治疗靶点以及预后评价等都具有十分重要的意义。本文运用免疫组化S-P法和PCR．单链构象多态性(PCR-SSCP)法，以血管内皮生长因子(VEGF)、p53基因来探索精原细胞瘤诊断和治疗的新思路、新方法。

　　1 材料与方法

　　1．1 病例和标本38例精原细胞瘤病例选自1991至2007年外科手术根治标本，主要来自江苏省人民医院、延边大学医学院、江苏省苏北人民医院和扬州市第一人民医院存档睾丸精原细胞瘤蜡块。按照WHO(2004)睾丸肿瘤分类标准，经扬州市病理诊断中心再次病理核实为精原细胞瘤。根据睾丸肿瘤临床分期标准 将精原细胞瘤统一进行临床分期，I期：肿瘤局限于睾丸，没有腹膜后淋巴结转移的情况；1I期：肿瘤转移至腹膜后淋巴结；111期：有膈上淋巴结转移，或淋巴结外转移(肺，肝，脑，骨)。其中I期15例；II期11例，Ⅲ期12例。对照用正常睾丸组织10例，来自扬州大学医学院病理教研室尸检标本。

　　1．2 试剂和方法二氨基联苯胺(DAB)染色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。采用免疫组化(S-P)法染色，所用一抗VEGF、p53及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(streptavidin—peroxidase，SP)试剂盒均购自购自北京中杉生物技术有限公司。按S-P试剂盒说明书操作。每批染色均设阴性空白对照(以PBS液代替一抗)。

　　p53引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。首先提取精原细胞瘤DNA进行PCR扩增，再配制2％的琼脂糖凝胶，对p53基因5、6、7、8外显子的PCR产物进行电泳，采用PCR．SSCP分析对组织标本进行p53基因突变的检测和判断。

　　1．3 结果判定高倍镜下随机观察记数10个高倍视野(×200)中阳性细胞所占百分数，根据阳性细胞数和显色强度分为：(一)，阳性细胞数小于5％或无阳性物质的表达；(+)，阳性细胞数5％ ～25％或显色浅；(++)，阳性细胞数25％ ～50％或显色深；(+++)，阳性细胞数大于50％及显色深。

　　1．4 统计学处理 所有数据采用SPSS 10．0及EXCEL 2003软件进行分析，组间比较选用x 检验，VEGF和p53表达的相关性分析选用Spearman等级相关比较，P<0．05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2．1 VEGF在精原细胞瘤中的表。

　　2．2 p53阳性在精原细胞瘤中细胞的细胞核表达。

　　2．3 VEGF和p53的相关检验相关系数(r)=0．183(P>0．05)，VEGF和p53表达之间无相关。

　　2．4 p53在精原细胞瘤中突变的检测结果选取11例精原细胞瘤标本，p53基因突变的有5例，突变率为45．45％ ，其中第5外显子突变的有3例、第7外显子突变的有1例、第8外显子突变的有1例。

　　3 讨论

　　3．1 精原细胞瘤中VEGF的表达 1989年Ferrara等 在体外培养的牛垂体细胞中分离出一种糖蛋白，它在体内外都表现出特异性的促进血管内皮细胞生长并诱导血管生成的作用，因此称之为血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF在许多肿瘤中都有过表达的现象，国内外许多报道表明，VEGF与精原细胞瘤之间关系密不可分。Restucci等 经实验得出在精原细胞瘤中，VEGF的表达以及微血管的密度远远高于正常组织，在转移的精原细胞瘤中VEGF的表达和微血管的密度也高于未发生转移的精原细胞瘤。

　　本实验通过对精原细胞瘤临床分期，检测VEGF在精原细胞瘤各期中的表达情况显示：I期与Ⅱ期、I期与Ⅲ期两组间比较有显着差异(P<0．05)，Ⅱ期与Ⅲ期之间比较无显着差异(P>0．05)；精原细胞瘤与正常对照组织之间比较有显着差异(P<0．01)。由此可见，VEGF随着精原细胞瘤临床分期的进展，阳性表达率也越来越高，虽然Ⅱ期与Ⅲ期之间比较无明显差异，但仍然可以看到表达量的递增趋势。而正常睾丸组织中VEGF阳性的例数少，且表达量显着低于肿瘤组织。此外本文亦发现VEGF在精原细胞瘤的肿瘤血管中大部分都表现出明显阳性，提示VEGF在精原细胞瘤的发生和临床进展中发挥着重要作用。由此推测，精原细胞瘤中肿瘤细胞的快速增殖在局部形成一个相对缺氧的微环境，缺氧反过来促进VEGF的分泌，进而促使肿瘤血管生成、微血管通透性增加，为肿瘤细胞进一步增殖提供营养基础，笔耕论文新浪博客，从而形成一个恶性循环。由此不难得出：VEGF不仅反映了精原细胞瘤中血管的生成能力，而且与其恶性进展、侵袭转移能力密切相关，提示VEGF是一个良好的反映睾丸精原细胞瘤生物学行为的指标之一，如果能在精原细胞瘤发生的早期敲除VEGF基因，似乎可以明显延缓甚至停止精原细胞瘤的发展，当然这种方法还需继续研究。

　　3．2 精原细胞瘤中p53的表达和变异p53基因是研究最为广泛深入的肿瘤相关基因，在50％ ～60％ 的人类各系统肿瘤中均发现有p53基因的突变。p53被称为“基因组卫士”，其主要生物学功能是维持细胞基因组的稳定，诱导细胞凋亡。

　　p53基因极其容易突变，Lewis等报道p53阳性表达在精原细胞瘤中为90％ ，在正常的睾丸组织中不表达，且在精原细胞瘤中p53随着肿瘤的临床分期增加而下降。Eid等¨ 报道p53基因在精原细胞瘤和胚胎性癌中阳性表达最强，p53表达在肿瘤临床早期最高，到后期反而降低。

　　本实验发现，p53在精原细胞瘤临床分期I期中的表达率达到93．33％ ，1I期与Ⅲ期的表达率分别为54．55％和50％ 。与前人结果比较一致，证明p53在精原细胞瘤发生的早期起着非常重要的作用。由此推断：精原细胞瘤在刚刚发生时，p53起着很重要的作用，随着肿瘤细胞的进一步发展，p53的作用逐渐减弱，最后在精原细胞瘤的晚期仅起很微弱的作用，甚至起不到促进肿瘤发展的作用。因此可提示，监测p53基因可以反映精原细胞瘤临床早期的生物学行为，可用以早期发现精原细胞瘤，若早期敲除突变的p53基因或避免p53基因发生突变，似可为延缓精原细胞瘤的发展起到一定作用。

　　本实验发现p53的5号外显子有3例突变，7号有1例突变，8号有1例突变，p53基因突变率为45．45％ ；5例突变中有4例是处于临床分期I期，1例处于Ⅱ期，说明从某种程度上可以认为p53在精原细胞瘤的早期容易发生突变，在精原细胞瘤的发生发展过程中，p53在早期起较大作用。

　　3．3 精原细胞瘤中VEGF的表达与p53的关系关于精原细胞瘤中VEGF与p53相关性的研究较少，本实验将VEGF与p53进行研究，发现两者并无相关性，反而发现VEGF在精原细胞瘤的发展中呈递增趋势，而p53仅仅在精原细胞瘤的发生早期起作用。由此说明，与两者相关的基因在精原细胞瘤中没有明显的协同作用，在精原细胞瘤中并不存在一条p53直接调节VEGF的通路，VEGF可能不受p53的直接调节。