天山根瘤菌MsiR蛋白调控机理的研究

发布时间：2017-10-20 21:10

  本文关键词：天山根瘤菌MsiR蛋白调控机理的研究

  更多相关文章： 天山根瘤菌 MsiR 转录调控 突变体文库筛选

【摘要】：中慢生型天山根瘤菌能够在甘草的根部共生结瘤固氮,提供植物生长所需的氮源。这种共生关系的建立依赖于根瘤菌与宿主植物之间复杂的信息交流。在甘草萌发初期,其分泌的抗菌物质刀豆氨酸能够杀死植株周围可能的有害细菌,而在天山根瘤菌中存在着刀豆氨酸的外运系统MsiAR系统,使其在甘草根际选择性的环境下继续繁殖,成为优势菌群,为后来的结瘤共生提供有力条件。MsiR蛋白,属于LysR转录调控家族成员,能够启动msiA基因的表达,刀豆氨酸作为辅助诱导物。LysR型转录调控蛋白是原核生物转录调控蛋白中最大的一类家族蛋白,参与调控的基因类型多种多样,包括毒力、代谢、群体感应和游动性等多种功能基因。本文以MsiR为主要研究对象,探究MsiR对msiA基因表达的调控机制,丰富对LysR家族的转录调控机制的认识,实现工业应用的价值。为研究MsiR对msiA的调控机制,将MsiR在大肠杆菌中进行重组表达及纯化。通过EMSA实验证实MsiR蛋白与启动子DNA的结合,加入刀豆氨酸能增强这种结合。与此同时,通过等温量热滴定确定了刀豆氨酸与MsiR之间存在相互作用,刀豆氨酸与MsiR结合的化学计量数为1,Kd值为1.86μM。通过5'race实验确定了 msiA基因的转录起始位点,并由此推测了-10区和-35区。采用启动子长度步移及定点突变确定了影响MsiR转录调控活性的5个重要位点：RBS-1 (-70,-67)、RBS-2 (-59,-56)、ABS-1 (-50,-47)、ABS-2 (-41,-37)、 ABS-3 (-30,-27),并由此预测了MsiR蛋白的转录调控模型：无刀豆氨酸存在的情况下,MsiR以四聚体形式存在,并呈现出开放型的构象,其结合到msiA调控区的RBS-1、RBS-2、ABS-2、ABS-3位点。此时,DNA的弯曲角度较缓,MsiR遮住了msiA启动子的-35区,使RNA聚合酶与启动子DNA结合效率大大降低,基因的表达水平处于极低的状态。在加入了刀豆氨酸以后MsiR仍以四聚体形式存在,但转变成为紧缩型的构象结合到msiA调控区的RBS-1、RBS-2、ABS-2位点,此时,DNA的弯曲角度变大,被遮盖的msiA启动子的-35区暴露出来,RNA聚合酶与启动子DNA的结合效率有了明显的提高,基因的表达水平处于较高的状态。最后,本研究构建了MsiR突变文库,进行了丧失转录调节活性突变株和37℃诱导高可溶性突变株的筛选,得到了影响MsiR生理特性的重要位点,具有十分重要的理论价值。
【关键词】：天山根瘤菌 MsiR 转录调控 突变体文库筛选
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q939.114
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-20
• 1.1 中慢生型天山根瘤菌概述9
• 1.2 MsiR的生理功能9-10
• 1.3 LysR家族转录调控蛋白10-14
• 1.3.1 LysR家族转录调控蛋白的典型结构10
• 1.3.2 LysR家族转录调控蛋白的调控模型10-11
• 1.3.3 LysR家族转录调控蛋白的应用前景11-14
• 1.4 转录调控因子的体外研究策略14-17
• 1.4.1 DNA与转录调控因子的相互作用与研究14-16
• 1.4.2 小分子配体与转录调控因子的相互作用与研究16-17
• 1.5 突变文库的构建策略17-18
• 1.5.1 易错PCR技术17-18
• 1.5.2 致突变菌株构建突变文库18
• 1.6 本课题研究目的意义及内容18-20
• 1.6.1 研究目的和意义18
• 1.6.2 研究内容18-20
• 2 材料与方法20-45
• 2.1 实验材料20-24
• 2.1.1 菌株20-21
• 2.1.2 质粒21-22
• 2.1.3 试剂22-23
• 2.1.4 酶与试剂盒23
• 2.1.5 实验仪器23-24
• 2.1.6 培养基及培养条件24
• 2.1.7 抗生素及其他常用试剂24
• 2.2 常用实验方法24-31
• 2.2.1 质粒抽提24-25
• 2.2.2 基因组的提取25
• 2.2.3 核酸回收25-27
• 2.2.4 转化与接合27-28
• 2.2.5 电泳28-29
• 2.2.6 酶反应体系29-30
• 2.2.7 信号检测30-31
• 2.3 MsiR生理活性的初步研究31-34
• 2.3.1 MsiR蛋白表达及纯化31-33
• 2.3.2 MsiR蛋白的生物活性33-34
• 2.4 MsiR蛋白的重要的调控位点34-41
• 2.4.1 引物序列34-37
• 2.4.2 MsiR结合DNA引起DNA弯曲角度的改变37
• 2.4.3 msiA基因的转录起始位点的确定37-38
• 2.4.4 msiA基因的启动子步移实验38-41
• 2.5 MsiR蛋白突变体的筛选41-45
• 2.5.1 丧失转录调控活性的MsiR蛋白突变体筛选41-43
• 2.5.2 37℃高可溶性的MsiR蛋白突变体筛选43-45
• 3 结果与讨论45-67
• 3.1 MsiR蛋白的生物活性45-52
• 3.1.1 组氨酸对MsiR蛋白的生理活性的影响45-46
• 3.1.2 MsiR蛋白表达载体的构建及MsiR蛋白的纯化46-47
• 3.1.3 MsiR与启动子区DNA的相互作用验证47-49
• 3.1.4 MsiR的寡聚化形态分析49-51
• 3.1.5 MsiR与小分子配体的相互作用的热力学参数51-52
• 3.2 MsiR蛋白的重要的调控位点52-58
• 3.2.1 MsiR结合DNA引起DNA弯曲角度的改变52-53
• 3.2.2 msiA基因的转录起始位点的确定53-54
• 3.2.3 msiA启动子区域的正向步移54-55
• 3.2.4 msiA启动子区域的反向步移55
• 3.2.5 MsiR蛋白与启动子DNA结合位点的确定55-57
• 3.2.6 MsiR蛋白的转录调控模型57-58
• 3.3 MsiR蛋白突变株的筛选58-67
• 3.3.1 突变文库的质量评价58-59
• 3.3.2 突变文库筛选的可行性分析及筛选条件59-61
• 3.3.3 不同类型的MsiR蛋白突变株61-67
• 4 结论67-68
• 5 展望68-69
• 6 参考文献69-76
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况76-77
• 8 致谢77

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 马腾;天山根瘤菌MsiR蛋白调控机理的研究[D];天津科技大学;2015年

，

本文编号：1069366