利用基因工程技术筛选高产赖氨酸芽孢杆菌的研究

发布时间：2017-10-22 00:20

  本文关键词：利用基因工程技术筛选高产赖氨酸芽孢杆菌的研究

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【摘要】：枯草芽孢杆菌产赖氨酸的代谢途径中最重要的产物是高丝氨酸,其代谢关键酶的编码基因是hom,在该代谢途径中如果敲除该基因,就可以使代谢流流向赖氨酸合成,使赖氨酸产量增加。所以本试验旨在利用基因工程技术选育枯草芽孢杆菌YB83高丝氨酸脱氢酶(homm)缺失株,研究homm基因缺失株对产赖氨酸产量的影响。模板用枯草芽孢杆菌YB83基因组DNA,PCR扩增得到hom基因连接到载体pMD19-T上,在E coliDH5a中转化,筛选得到重组质粒pMD19-T-hom。而后用质粒pET-28a为模板,PCR扩增获得km基因,将km基因用BssH2酶切后连接到重组质粒pMD19-T-hom上,在大肠杆菌E coli DH5a中转化,通过卡那霉素抗性筛选得到质粒载体pMD19-T-hom::km。通过电击转化法把pMD19-T-hom::km在枯草芽孢杆菌YB83中转化,通过PCR验证成功敲除枯草芽孢杆菌YB83染色体上的hom基因。通过抗性筛选得到的枯草芽孢杆菌YB83高丝氨酸脱氢酶缺失菌株赖氨酸产量提高了2.07倍,枯草芽孢杆菌YB83缺失菌株经过24h发酵赖氨酸产量达0.375g/L,而枯草芽孢杆菌YB83菌株经过24h赖氨酸的产量为0.181g/L。
【关键词】：基因工程 芽孢杆菌 赖氨酸 高丝氨酸脱氢酶
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 研究背景与意义8-15
• 1.1 赖氨酸概述8-12
• 1.1.1 赖氨酸的结构及理化性质8
• 1.1.2 赖氨酸的功能及用途8-9
• 1.1.3 赖氨酸的生产现状9-10
• 1.1.4 赖氨酸的生产方法10-11
• 1.1.5 国内外赖氨酸菌种选育发展的现状11-12
• 1.2 芽孢杆菌研究现状12-14
• 1.2.1 芽孢杆菌概述12-13
• 1.2.2 基因工程技术在芽孢杆菌中的研究进展13-14
• 1.3 题背景与意义14
• 1.4 主要研究内容14-15
• 2 材料与方法15-26
• 2.1 材料15-18
• 2.1.1 菌种与质粒15
• 2.1.2 主要试剂15-16
• 2.1.3 培养基16-17
• 2.1.4 主要药品17-18
• 2.1.5 主要仪器18
• 2.2 方法18-26
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌YB83菌株的培养、筛选与保存18
• 2.2.2 提取枯草芽孢杆菌YB83菌基因组DNA18-19
• 2.2.3 PCR扩增HOM基因及回收19-20
• 2.2.4 DNA切胶回收20-21
• 2.2.5 重组质粒PMD19-T-HOM的构建和鉴定21-22
• 2.2.6 质粒提取试剂盒(QIAGEN)提取质粒22-23
• 2.2.7 PCR扩增卡纳抗性基因(KM)23-24
• 2.2.8 构建质粒载体PTG19-T-HOM::KM24-25
• 2.2.9 制作电击转化的枯草芽孢杆菌YB83感受态25
• 2.2.10 电击转化枯草芽孢杆菌YB8325-26
• 2.2.11 转化子筛选26
• 2.2.12 枯草芽孢杆菌YB83缺陷菌株的培养与保存26
• 2.2.13 枯草芽孢杆菌YB83菌株和枯草芽孢杆菌YB83缺失菌株发酵液中赖氨酸的测定26
• 3 结果与分析26-30
• 3.1 目的基因PCR扩增26-27
• 3.2 重组质粒PMD19-T-HOM的验证27-28
• 3.3 质粒载体PMD19-T-HOM::KM的构建和鉴定28-29
• 3.4 电击转化结果的验证29
• 3.5 枯草芽孢杆菌YB83中HOM基因缺失菌株的形态鉴定29
• 3.6 枯草芽孢杆菌YB83中HOM基因缺失对赖氨酸产量的影响29-30
• 4 讨论30-32
• 5 结论32
• 6 创新点32-33
• 参考文献33-38
• 致谢38-39
• 作者简介39

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