全细胞反应器生产α-熊果苷
本文关键词:全细胞反应器生产α-熊果苷
【摘要】:a-熊果苷,一种高效、安全、配伍性强的天然美白活性物质。它比同分异构体β-熊果苷的美白效果更好、更安全。呈白色针状结晶或粉末,能够加速黑色素的分解与排泄,进而减少皮肤中黑色素的沉积,祛除色斑和雀斑,同时还有杀菌、消炎的作用,主要用于高级化妆品的制备。熊果苷的合成是当前的一个研究热点,其合成有多种途径:天然提取法、植物细胞培养法、有机合成法和生物转化法等。采用前三种方法合成熊果苷由于分离纯化困难、产物含量低、生产成本高而很难实现工业化生产,故目前生产α-熊果苷一般通过来源于不同微生物的酶进行糖基转移反应,让一分子的二糖和一分子的对苯二酚在酶的作用下转化生成一分子α-熊果苷,利用生物转化法生产α-熊果苷相比其他方法具有很大优势,但目前国内外关于这方面的研究很少,值得引起我们的注意。本论文将来源于耐辐射球菌Deinococcus radiodurans CGMCC 1.3828的淀粉蔗糖酶基因导入大肠杆菌中,构建基因工程菌株,用该菌株作为催化剂进行全细胞转化生产α-熊果苷,同时对比两株基因工程菌TyAS-pet28a-rosetta(本实验室构建)和DrAS-pet28a-rosetta催化生产α-熊果苷能力的大小,结果表明TyAS-pet28a-rosetta催化生产α-熊果苷的能力比DrAS-pet28a-rosetta要强很多,转化率是后者的2.92倍,下一步通过优化转化工艺来提高α。熊果苷的产量。本论文主要研究采用全细胞催化法生产a-熊果苷的工艺的优化,确定了最佳反应条件为:温度30℃,对苯二酚浓度180mM,蔗糖和对苯二酚摩尔比为5.5:1,添加0.5mM Vc,反应时间为6h,转速为150rpm,细胞浓度为300D/mL,反应液为100mM pH7.0的Tris-HCl缓冲溶液。采用此方法来生产α-熊果苷,转化率可达到99%,产量可达45.36g/L,生产效率为7.56g/L/h,这一水平远远好于目前所有文献中已报道的水平,同时在生产过程中利用蔗糖而不是相对较贵的麦芽糖作为供体,且无需用纯酶来进行反应,这样将大大降低α-熊果苷的生产成本。该方法具有原料价廉、反应条件容易控制、反应周期短、产物纯度高、生产效率高等优点,具有重要的工业化意义。分离纯化反应液以获得纯度较高的α-熊果苷具有重要的工业化意义,先把反应液通过大孔吸附树脂H107进行一步纯化,分别收集含不同组分的洗脱液,把含有产物的洗脱液进行浓缩结晶,此时产物的纯度为98%以上,通过高效液相色谱(HPLC)检测,还含有少量对苯二酚,故还需进一步纯化。采用硅胶柱进行二步纯化,产物经高效液相色谱(HPLC)检测,纯度可达到99.9%以上,通过比较α-熊果苷标准品与产物的高效液相色谱图发现,产物出峰时间与a-熊果苷标准品一致均为7.324 min。产物经核磁共振分析其化学结构,最终确定产物为α-熊果苷。
【关键词】:α-熊果苷 全细胞转化 分离纯化 结构鉴定
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q81
【目录】:
- 中文摘要12-14
- ABSTRACT14-16
- 符号说明16-17
- 第一章 绪论17-28
- 1.1 熊果苷概述17-21
- 1.1.1 熊果苷简介17-18
- 1.1.2 熊果苷的理化性质18
- 1.1.3 熊果苷的美白机理18-20
- 1.1.4 熊果苷的应用20-21
- 1.1.4.1 化妆品20-21
- 1.1.4.2 其他用途21
- 1.2 熊果苷的制备方法概述21-27
- 1.2.1 熊果苷的传统制备方法21-23
- 1.2.1.1 天然产物提取法21-22
- 1.2.1.2 植物组织培养法22-23
- 1.2.1.3 有机合成法23
- 1.2.2 熊果苷的高效制备方法23-27
- 1.2.2.1 酶转化法24-26
- 1.2.2.2 全细胞转化法26-27
- 1.3 选题的目的及意义27-28
- 第二章 淀粉蔗糖酶的表达、纯化及活性测定28-51
- 2.1 材料和方法28-44
- 2.1.1 试剂、仪器和菌种28-30
- 2.1.2 菌株的培养及分子克隆方法30-38
- 2.1.2.1 培养基的配制30
- 2.1.2.2 标准溶液的配制30-33
- 2.1.2.3 琼脂糖凝胶的配制33
- 2.1.2.4 SDS-PAGE的配制和电泳检测33-34
- 2.1.2.5 大肠杆菌的培养34-35
- 2.1.2.6 PCR扩增及其产物回收35
- 2.1.2.7 双酶切及琼脂糖凝胶回收35-36
- 2.1.2.8 连接36
- 2.1.2.9 转化36-37
- 2.1.2.10 阳性克隆鉴定37-38
- 2.1.3 淀粉蔗糖酶的构建和表达38-41
- 2.1.3.1 DrAS-pet28a-rosetta的构建与表达38-40
- 2.1.3.2 DrAS-pYB1s-BW25113的构建与表达40-41
- 2.1.4 淀粉蔗糖酶的纯化41-43
- 2.1.4.1 目的蛋白的纯化41-42
- 2.1.4.2 目的蛋白的保存42
- 2.1.4.3 目的蛋白的浓度测定42-43
- 2.1.5 淀粉蔗糖酶的酶活测定43-44
- 2.1.5.1 二硝基水杨酸(DNS)的配制44
- 2.1.5.2 果糖标准曲线的绘制44
- 2.1.5.3 淀粉蔗糖酶酶活的测定44
- 2.1.5.4 淀粉蔗糖酶酶活的计算44
- 2.2 结果与分析44-49
- 2.2.1 淀粉蔗糖酶的表达44-48
- 2.2.1.1 DrAS-pet28a-rosetta的表达44-47
- 2.2.1.2 DrAS-pYB1s-BW25113的表达47-48
- 2.2.2 淀粉蔗糖酶的纯化48
- 2.2.3 淀粉蔗糖酶的酶活测定48-49
- 2.3 本章小结49-51
- 第三章 全细胞催化法生产α-熊果苷以及转化条件的优化51-63
- 3.1 材料与方法51-54
- 3.1.1 材料51
- 3.1.2 比较两株基因工程菌催化生产α熊果苷的能力大小51
- 3.1.3 优化全细胞催化法合成α熊果苷的转化条件51-54
- 3.1.3.1 Vc浓度52
- 3.1.3.2 蔗糖浓度52
- 3.1.3.3 转化温度52
- 3.1.3.4 转化时间52-53
- 3.1.3.5 对苯二酚浓度53
- 3.1.3.6 细胞浓度53
- 3.1.3.7 不同温度下表达的菌体53
- 3.1.3.8 二次转化53-54
- 3.1.3.9 冻存细胞转化54
- 3.1.4 α-熊果苷的检测54
- 3.1.4.1 HPLC法54
- 3.1.4.2 TLC法54
- 3.2 结果与讨论54-62
- 3.2.1 α-熊果苷和对苯二酚标准曲线的绘制54-55
- 3.2.2 两株基因工程菌催化生产α-熊果苷的能力大小比较55
- 3.2.3 全细胞催化法合成α-熊果苷转化条件的优化结果55-62
- 3.2.3.1 不同浓度Vc对α-熊果苷产量的影响55-56
- 3.2.3.2 蔗糖浓度对反应转化率的影响56-57
- 3.2.3.3 转化温度对反应转化率的影响57
- 3.2.3.4 反应时间对反应转化率的影响57-59
- 3.2.3.5 对苯二酚浓度对α-熊果苷产量的影响59-60
- 3.2.3.6 不同细胞浓度对反应转化率的影响60
- 3.2.3.7 不同温度下表达的酶对反应转化率的影响60-61
- 3.2.3.8 二次转化对反应转化率的影响61
- 3.2.3.9 用冻存细胞转化对反应转化率的影响61-62
- 3.3 本章小结62-63
- 第四章 α-熊果苷的分离纯化和结构鉴定63-72
- 4.1 α-熊果苷的分离纯化63-69
- 4.1.1 材料与仪器设备63
- 4.1.2 分离纯化方法63-65
- 4.1.2.1 大孔吸附树脂柱层析的操作63-64
- 4.1.2.2 硅胶柱层析的操作64-65
- 4.1.3 结果与讨论65-69
- 4.1.3.1 大孔吸附树脂H107进行一步纯化65-67
- 4.1.3.2 硅胶柱进行二步纯化67-69
- 4.2 核磁共振鉴定化学结构69-70
- 4.2.1 仪器及试剂69
- 4.2.2 NMR谱解析69-70
- 4.2.2.1 化学位移归属69-70
- 4.2.2.2 数据解析70
- 4.3 本章小结70-72
- 总结与创新点72-73
- 参考文献73-77
- 致谢77-79
- 在读期间参与发表文章79-80
- 学化论文评阅及答辩情况表80
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