猪腺病毒多重PCR方法的建立及初步应用

发布时间：2017-11-08 20:21

  本文关键词：猪腺病毒多重PCR方法的建立及初步应用

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【摘要】：猪腺病毒是于1964年在英格兰首次被分离,此后,通过病毒分离和血清学调查逐步证明猪腺病毒在猪群中广泛存在。但是腺病毒作为自然感染病例病原体的重要性以及猪腺病毒的危害和造成的经济损失,迄今为止尚不完全清楚。目前对猪腺病毒的诊断手段有病毒分离、直接免疫荧光实验、琼脂免疫扩散试验、血凝,血凝抑制和病毒中和试验、分子生物学方法。病毒分离、直接免疫荧光实验这些诊断方法相对比较繁琐,花费的经费较多,检测时间长,无法方便快捷地对猪腺病毒进行大规模调查研究。目前国外和国内都有学者用分子生物学方法对猪腺病毒进行检测,不过PCR至今未成为猪腺病毒的常规检测手段。本研究的目的是建立一种快速、简便、高灵敏度的猪腺病毒多重PCR检测方法,为更好的了解猪腺病毒感染和传播提供技术手段。猪腺病毒多重PCR方法的建立：首先从GenBank数据库中下载四个血清型PADV的基因序列,用DNAstar软件对下载序列进行同源性性分析,从不同血清型PADV各自的序列中找到型内比较保守但血清型之间存在变异的区域,用Primer5.0软件进行引物设计。最后对PCR引物浓度、退火温度进行优化,并进行敏感性和特异性分析。结果,4个血清型PADV中,PADV3和PADV5在保守的六邻体部位分别设计了引物,PADV1在基因ORF1-5区域设计了引物,PADV4在E1B进行了引物设计。各引物浓度在0.6umol、退火温度55℃时,多重PCR效果最佳；且通过对流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、蓝耳病毒、杯状病毒、猪流感病毒、星状病毒的检测,发现该多重PCR方法具有很好的特异性。猪腺病毒多重PCR方法的初步应用：采用建立的多重PCR方法对猪场收集的318份猪肛门拭子,80份猪肺脏,173份猪鼻拭子,180份猪血清进行检测。结果肛门拭子的PADV检测阳性率为20.75%,鼻拭子的阳性率为10.4%,血清的阳性率为1.66%,肺脏阳性率为7.5%。将检测到阳性样品的PCR产物送公司进行基因测序分析同样证明了建立的多重PCR方法具有很好的特异性,可以用于猪腺病毒的检测,为猪腺病毒感染的调查和诊断提供了重要的技术支持。从检测结果发现在患病猪的感染率高于健康猪,猪在每个季节的感染率无明显差别,饲养环境差的猪场感染率高于饲养环境好的。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651

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本文编号：1158683