NDV7793-HN蛋白在SF9细胞中的表达

发布时间：2017-12-06 10:33

  本文关键词：NDV7793-HN蛋白在SF9细胞中的表达

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【摘要】：研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)属于禽类病毒,能引起禽类大面积的死亡,给家禽业造成严重的经济损失。NDV病毒对人类基本不致病,但能杀死肿瘤细胞,已被用于抗肿瘤的生物治疗上。2006年以来我们课题组利用从江西省鄱阳湖野鸭分离得到的1株NDV 7793弱毒株进行NDV抗肿瘤治疗的系列研究,积累了大量NDV抗肿瘤生物治疗基础研究的经验。为了能更深入进行研究,我们拟利用真核表达基因工程系统对NDV的表面蛋白进行表达和纯化。NDV含有多种蛋白,其中的血凝素神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin neuraminidase,HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白,具有血凝素和神经氨酸酶的功能,在病毒侵染细胞的过程中,HN起到识别细胞膜表面的唾液酸受体和介导病毒吸附细胞膜的作用。HN不仅是NDV引起禽类致病的主要蛋白,而且在NDV发挥抗肿瘤功能上起至关重要的作用,研究HN蛋白的功能有重要意义。为了获得高品质的HN蛋白进行深入的研究,我们将利用昆虫细胞——草地贪夜蛾卵巢细胞系(SF9)来表达NDV 7793HN蛋白,这是我们实验室第一次利用SF9细胞表达NDV 7793弱毒株的HN蛋白。方法1.提取NDV7793的RNA,逆转录成c DNA,通过PCR将HN基因进行点突变,并将Nco I/Xho I酶切位点引入NDV7793HN基因片段。2.将HN基因片段通过酶切和连接的方法连接到p Fast Bac1 HT B质粒载体,以构建p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒,将质粒送测序公司进行测序。3.将测序正确的p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒转化到感受态细胞DH10Bac TM中,提取HN杆粒,PCR验证HN杆粒。4.用脂质体转染试剂将HN杆粒转入进昆虫SF9细胞中,培养48小时后收取细胞培养上清,获得第一代病毒,接着用一代病毒感染SF9细胞,培养60小时后收取细胞培养上清,获得二代病毒,最后用二代病毒感染SF9细胞,培养72小时后收集细胞,用SDS-PAGE检测HN蛋白的表达。结果1.从NDV 7793病毒中提取出了病毒的RNA,RNA逆转录成了c DNA,PCR扩增出1710bp带有Nco I/Xho I酶切位点的HN基因片段。2.测序结果表明:p Fast Bac1 HT B-HN质粒构建成功,HN中的Xho I酶切位点被去除。3.从DH10Bac TM细胞其取出HN杆粒,PCR验证HN杆粒构建成功。4.SDS-PAGE结果显示在HN杆粒感染的SF9细胞裂解液中比未感染病毒的SF9细胞裂解液在67k Da左右出现了一个明显的条带,这与HN的理论分子量吻合。结论我们成功构建并获得p Fast Bac1 HT B-HN质粒,即HN杆粒,并将该杆粒转染昆虫SF9细胞并得到表达的目的蛋白,初步鉴定为HN蛋白,为今后用基因工程技术获得的HN研究NDV感染宿主细胞(肿瘤细胞)奠定了基础。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨薇;吴红梅;李佳楠;;重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达[J];江汉大学学报(自然科学版);2017年01期

2 金宏昊;梁明华;姜建国;;特氏杜氏藻中乙酰辅酶A合成酶的基因克隆、表达、纯化及活性测定[J];现代食品科技;2017年03期

3 黄盼柳;梁莹;樊晓晖;宋德志;高灵茜;梁爽;孙盼;张彬;张磊;崔梦一;;NDV7793对肺腺癌皮下移植瘤小鼠肿瘤组织CEACAM1表达的影响[J];基因组学与应用生物学;2016年09期

4 蒋娟娟;任东升;段鑫;张艳;;CHO细胞无血清培养基的工艺优化[J];天然产物研究与开发;2016年04期

5 武婕;张晓雪;余河水;李薇;贾宇平;郭江玉;张丽娟;宋新波;;毕赤酵母工程菌高密度发酵研究与进展[J];中国生物工程杂志;2016年01期

6 宋德志;梁莹;樊晓晖;殷君;宫金伶;赖振屏;高灵茜;;新城疫病毒通过上调小鼠NK细胞TRAIL表达杀伤Novikoff小鼠肝癌细胞[J];细胞与分子免疫学杂志;2015年05期

7 林晓栩;林新坚;邱宏端;陈龙军;陈济琛;;乳糖诱导对重组大肠杆菌表达CGTase的影响[J];食品工业科技;2015年17期

8 余小霞;田健;刘晓青;伍宁丰;;枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展[J];生物技术通报;2015年02期

9 李玲;凌文;石牡丹;尚广东;;基于基因组的TEV蛋白酶的高表达[J];南京师大学报(自然科学版);2014年03期

10 罗辑;周国英;朱积余;;核型多角体病毒基因组学研究进展[J];林业科学研究;2014年04期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 李祥;杆状病毒感染的分子机理研究[D];中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）;2007年

2 张晓舟;枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用[D];南京农业大学;2006年

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本文编号：1258315