肠道病毒71型3D蛋白结构与功能研究

发布时间：2017-12-07 22:09

  本文关键词：肠道病毒71型3D蛋白结构与功能研究

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【摘要】：肠道病毒 71 型(enterovirus71,EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,属小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员。作为具有嗜神经性的肠道病毒,EV71感染导致的临床症状轻重不一,轻者仅表现为发热和手、足、口等处的疱疹等,而严重者可伴发无菌性脑膜炎、脑脊髓炎和神经源性肺水肿等中枢神经系统并发症,甚至引起患儿死亡。目前重症HFMD多由EV71导致,其致病机制尚未明了。本课题组前期研究显示,EV71病毒株SDLY1和SDLY107在病毒复制能力和毒力上存在差别,强毒株SDLY107的复制能力及毒力均大于弱毒株SDLY1;3D蛋白作为RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中具有关键作用。因此,本研究利用反向遗传技术,将弱毒株SDLY1的3D编码区置换入强毒株SDLY107中并拯救出重组病毒,通过体外实验研究3D蛋白在病毒复制能力和毒力中的作用。同时,本研究利用结构生物学技术,筛选出弱毒株SDLY1和强毒株SDLY107的3D蛋白晶体,后期将通过X射线衍射解析其晶体结构,为3D蛋白毒力位点的定位提供依据。目的:1.构建并拯救重组病毒SDLY107(1-3D),通过体外实验研究3D蛋白对病毒复制能力和毒力的影响。2.筛选出弱毒株SDLY1和强毒株SDLY107的3D蛋白晶体,解析蛋白结构并分析两株病毒3D蛋白中的突变位点对蛋白结构的影响,找出有意义的突变位点,为3D蛋白毒力位点的定位提供依据。方法:1.将弱毒株SDLY1的3D编码区置换入强毒株SDLY107,利用体外转录获取感染性RNA,转染Vero细胞,盲传3代拯救出重组病毒SDLY107(1-3D);2.使用 PCR、实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对重组病毒进行鉴定,测序验证;使用Vero细胞收获重组病毒,用50%终点法测定病毒滴度;3.使用弱毒株SDLY1株、强毒株SDLY107株和重组病毒SDLY107(1-3D)感染RD细胞(MOI=100),分别在37℃和39.5℃条件下培养,每12h收取细胞上清,使用qRT-PCR测定病毒的生长曲线,比较不同毒株复制能力的差异;4.使用弱毒株SDLY1株、强毒株SDLY107株和重组病毒SDLY107(1-3D)感染RD细胞(MOI=10),分别在37℃和39.5℃条件下培养,48h后分别通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试验和CCK-8试验检测不同毒株对细胞的损伤作用;5.PCR扩增SDLY1株和SDLY107株3D片段,分别将其插入原核表达载体PET32a(+)和pEGX-6P-1中构建重组质粒;6.将重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)DE3中,使用IPTG诱导蛋白表达,收集菌体进行超声破碎,使用亲和层析、离子交换层析和分子筛层析对含有3D蛋白的上清液进行纯化,使用坐滴法筛选3D蛋白晶体。结果:1.重组感染性RNA转染Vero细胞后,接种至第3代观察到细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),PCR、qRT-PCR、间接免疫荧光试验和测序结果证实重组病毒SDLY 107(1-3D)拯救成功;50%终点法得到SDLY1株、SDLY107 株和 SDLY107(1-3D)株的 CCID50 分别为10-6.0/ml、10-6.5/ml和10-6.5/ml;2.不同毒株生长曲线的测定结果显示,37℃条件下,重组病毒SDLY107(1-3D)的复制能力略弱于SDLY107株,略强于SDLY1株;39.5℃条件下,SDLY107株的复制能力稍有下降,而SDLY1株和SDLY107(1-3D)的复制能力均显著下降,SDLY107(1-3D)略强于 SDLY1 株;3.LDH试验和CCK-8试验结果显示,37℃条件下,重组病毒SDLY107(1-3D)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,强于SDLY1株,差异有统计学意义(P0.05);39.5℃条件下,SDLY1株和SDLY107(1-3D)对细胞的损伤作用显著降低,SDLY107(1-3D)强于SDLY1株,差异有统计学意义(P0.05);4.PCR扩增得到的3D片段分别插入原核表达载体PET32a(+)和pEGX-6P-1中,得到重组质粒 PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-107',测序正确;5.3D蛋白表达并纯化后,得到了高纯度、高浓度的3D蛋白样品,PET32a-3D-1、PET32a-3D-107、pEGX-6P-3D-1'和 pEGX-6P-3D-107'表达的 3D 蛋白浓度分别为 14.8mg/ml、12.5mg/ml、9.0mg/ml 和 7.0mg/ml;6.PET32a-3D-1和PET32a-3D-107表达的3D蛋白未观察到晶体生成;pEGX-6P-3D-1'和pEGX-6P-3D-1077表达的3D蛋白在0.4mol/L酒石酸钾钠条件下观察到晶体生成。结论:1.成功构建并拯救了重组病毒SDLY107(1-3D),重组病毒SDLY107(1-3D)的复制能力和毒力均下降,在高温条件下下降尤为明显,表明3D蛋白存在影响病毒毒力的位点,且毒力位点具有一定的温度敏感性。2.成功构建了 3D蛋白原核表达系统,得到了高纯度、高浓度的3D蛋白,通过晶体筛选获得了 SDLY1和SDLY107的3D蛋白晶体,为解析两株病毒的3D蛋白结构并分析3D蛋白中的突变位点对蛋白结构的影响以找出有意义的突变位点奠定基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373.2

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