Cytophaga hutchinsonii纤维素降解关键基因和高效启动子序列的筛选鉴定

发布时间：2017-12-08 04:06

  本文关键词：Cytophaga hutchinsonii纤维素降解关键基因和高效启动子序列的筛选鉴定

  更多相关文章： Cyphaga hutchinsonii 纤维素降解 转座诱变 插入失活 TonB依赖受体 甲硫氨酸合成基因 启动子

【摘要】：纤维素作为植物生物质的主要构成成分,是极为重要的可再生资源,而在长期进化过程中形成的抗降解屏障使其尚未得以有效利用。自然界中存在众多可降解纤维素的微生物,其中好氧革兰氏阴性细菌Cytophaga hutchinsonii具有高效的结晶纤维素降解能力,但其降解机制至今仍是未解之谜。为了研究C.hutchnsonii独特的纤维素降解机制,本论文主要从以下两个方面进行了研究工作:一方面通过正反向遗传手段对基于生物学信息学分析和转座诱变得到的基因进行定点插入失活,检测突变株纤维素的利用情况,来筛选鉴定C.hutchinson.中参与纤维素降解利用的重要功能基因;另一方面通过检测C.hutchinsoniii内源基因启动子驱动报告基因表达的能力,获得可用于基因回补及蛋白表达的高效启动子序列,以进一步完善其遗传操作体系。本文的主要研究结果如下:一、构建TonB依赖受体编码基因chu_0089的插入失活突变株,发现突变株在纤维素利用上表现出显著延迟,表明该基因在纤维素降解过程中发挥着重要的作用。我们通过转录组数据分析发现,chu_0089在突变株T127(chu_1276插入失活菌株,纤维素利用缺陷)中相对于野生型菌株表现出特异性下调。Chu_0089注释为外膜通道蛋白TonB依赖受体的编码基因。为了研究chu_0089在纤维素降解中的作用,我们对chu_0089进行了定点插入失活。生长检测发现突变株在葡萄糖上的生长没有受到影响,而在纤维素和纤维二糖的生长上均表现出明显的延迟现象。Chu_0089的回补能够恢复突变株的纤维素利用能力,证明突变株的纤维素利用延迟是由chu_0089的特异性插入失活导致,chu_0089在菌株纤维素利用中发挥着重要作用。二、通过转座诱变筛选鉴定到两个可能与甲硫氨酸合成相关的基因chu_0694和chu_1812,它们在纤维素降解过程中发挥着重要的作用。利用转座子pHimarEM1诱变,筛选到两株纤维素利用缺陷菌株T950和T964,质粒拯救发现转座子插入位点分别是chu_0694和chu_1812。通过Southern blot验证,转座突变株中的转座插入位点是专一性的。这两个基因分别注释为2-酮-4-丁酸甲硫酯转氨酶(2-keto-4-methylthiobutyrate aminotransferase)和 O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)的编码基因,推测在甲硫氨酸的循环再生途径及从头合成途径中发挥着作用。我们分别构建了chu_0694和chu_1812的定点插入失活突变株,突变株表现出与转座诱变突变株相同的纤维素利用缺陷表型,表明这两个基因在纤维素利用中发挥着重要作用,其在甲硫氨酸合成及纤维素降解中的具体作用机制需要今后进一步探讨研究。三、通过检测C.hutchinsonii中不同内源启动子驱动报告基因的表达情况,发现chu_2750的启动子可有效启动基因在C.hutchinsonii中的表达。通过转录组分析及文献报道,我们在C.hutchinsonii中选取了 15个可能的高水平表达基因的启动子,以GFP(绿色荧光蛋白)为报告基因检测了它们的表达启动能力。结果分析发现,chu_2750的启动子能够成功启动GFP的表达,而其它14个基因的启动子不能实现表达;当以LacZ(β-半乳糖苷酶基因z)为报告基因时,选取的chu_2750及其它3个基因的启动子均可启动LacZ的表达,但是以chu_2750启动子的启动能力最高。我们利用chu_2750的启动子成功地实现了chu_0089在其插入失活突变株中的基因回补。该部分研究为内源及外源基因在C.hutchinsonii中的组成型表达奠定了良好基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1264948