基于恒温扩增的RNA检测方法的研究

发布时间：2017-12-08 10:39

  本文关键词：基于恒温扩增的RNA检测方法的研究

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【摘要】：核酸是遗传变异的物质基础,是遗传信息的载体,在蛋白质生物合成中起十分重要的作用。生物体的遗传、变异、生长发育、细胞分化等都与核酸密切相关。核酸包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。其中RNA在合成蛋白质的过程中起着非常重要的作用。同时,在生物分析、疾病诊断和食品安全中,RNA常作为分析标志物。因此,建立一种简单、易于操作和灵敏快速的RNA检测方法是生化领域中的主要目标,这也是本论文的主要研究内容。本论文基于恒温核酸扩增的检测方法,构建了一种设计简单的,快速的检测RNA的新方法。在第二章中,本论文建立了变性泡介导的链交换扩增方法(Bubble-mediated strand exchange amplification,SEA)对RNA进行检测。该方法类似于PCR,它仅仅利用一对引物和一种DNA聚合酶去实现变性,退火,延伸这3个循环步骤。SEA方法利用链呼吸作用来打开双链,而不是通过热变性。双链DNA依靠呼吸作用产生DNA变性泡。在DNA变性泡中的单链区域设计引物进行等温扩增,放大信号。同时,利用本课题组对Bst一系列聚合酶具有反转录活性的这一新发现,在SEA反应体系中加入Bst 2.0 WarmstartTM可以实现RNA的一步法检测。利用此方法对大肠杆菌16s RNA进行了检测,检测限可以达到100 amol,实时荧光检测结果表明该方法对RNA检测是可行的。通过加入10%的牛血清使反应体系复杂化,实验结果显示,该方法在较为复杂的体系中可以进行反应,验证了该方法具有较强的抗干扰能力。由此表明,SEA是一种简单,可以一步法检测RNA的方法。在临床应用和现场快速检测方面具有重要意义。由于,SEA中双链的解开是依靠DNA双链自身的变性泡结构。因此,反应所需要的时间较长。为了减少反应所需要的时间,加快反应速率。在第三章中对SEA方法不断进行改进。通过在SEA反应中加入了一条带有限制性核酸内切酶位点的引物链来加快反应速率。将SEA方法和指数等温扩增方法连用,利用限制性核酸内切酶将反应产生的双链切成较短的两个片段。在反应温度下,较短的双链自发打开的效率更快。但是,由于在体系中需要较高浓度的带有内切酶的引物链,从而产生了较高的非特异性导致实验失败。因此在本论文的第三章中对产生非特异性的原因进行了探讨。综上所述,本论文建立了一种简单的RNA检测新方法,实现了一步法检测RNA。
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈晶晶;;探究丙肝患者在治疗过程中血清RNA与抗HCV定量检测及其生化指标的相关性[J];中国农村卫生;2017年04期

2 孟兆祥;张伟;檀建新;马晓燕;;一种DNA扩增的新技术:利用热稳定的Bst DNA聚合酶驱动跨越式滚环等温扩增反应[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年09期

3 周殿明;蒋健晖;沈国励;俞汝勤;;基于核酸分子识别的电化学分析方法与应用[J];电化学;2011年03期

4 黄律;龙进学;翟少伦;刘长龙;张荣;袁世山;;猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用[J];动物医学进展;2011年01期

5 ;A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus[J];Virologica Sinica;2010年01期

6 张文慧;王伟利;郑聪;刘明;钱爱东;;多重反转录聚合酶链式反应检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的研究[J];华南农业大学学报;2009年03期

7 邹亚伟;封志纯;胡斌;乔英飒;吴梓梁;陈福雄;叶铁真;;新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因[J];南方医科大学学报;2006年04期

8 孙非,肖兰,刘志屹,张淑芹,刘建伟,李忠谊,许守民;限制性内切酶分析法在柯萨奇B组病毒检测及分型中的应用[J];中华检验医学杂志;2004年01期

9 符征,汪吉宝;Northern印迹法检测喉鳞状细胞癌中表皮生长因子受体mRNA的表达[J];临床耳鼻咽喉科杂志;2002年12期

10 邱广斌,邱广蓉,富伟能,孙开来;反转录聚合酶链式反应法检测端粒酶催化蛋白亚单位mRNA[J];中国实验诊断学;2001年06期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 汤丹;新型生物传感器的研究及其在核酸和蛋白质检测方面的应用[D];吉林大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 林彩琴;基于滚环扩增的目视法核酸检测技术[D];浙江大学;2013年

2 申志勇;PCR引物特异性评估体系及多重PCR引物设计系统的构建与应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年

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本文编号：1266087