利用结合Xist第一内含子的Tale-dTF建立R6-MEF细胞系

发布时间：2017-12-10 17:22

  本文关键词：利用结合Xist第一内含子的Tale-dTF建立R6-MEF细胞系

  更多相关文章： Xist Tale-dTF R6-MEF 干性基因表达

【摘要】：X染色体失活是雌性哺乳动物早期胚胎发育的重要事件,而非编码基因Xist是X染色体失活的关键调控因子。XistRNA通过包被即将失活的X染色体并使其发生沉默。而在分化细胞的重编程过程中,失活的X染色体伴随着Xist的下调而发生重活化,在ESC中,多能性因子(如NANOG,SOX2和OCT4等)结合到Xist基因的第一内含子区,以稳定ESC的多能性状态。但有研究报道,Xist的表达不会因为敲除第一内含子而受到影响,也不能提高诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)的制备效率。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-like effectors based designer Transcription Factors,Tale-dTFs)Repressor 6(以下称 R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。本研究利用Xist抑制性Tale-dTF R6成功制备了 R6-MEF细胞系,并通过细胞生长曲线制备、免疫荧光染色、实时定量PCR及流式细胞仪筛选分析等技术手段,证明了该R6-MEF细胞系具有不同于野生型MEF细胞系的特点,具体如下:1、利用脂质体转染法制备的R6-MEF细胞形态类似于低代次的野生型MEF细胞系,呈短梭状,而生长速率明显高于野生型MEF细胞系;R6-MEF细胞系可传至50代以上,且未见明显异常。2、实时定量PCR结果显示,R6-MEF中的多能性基因Nannog、Sox2、Oct4及生殖相关基因Prdm14均有不同程度的上调;但R6-MEF中NANOG的免疫荧光染色结果呈阴性;而雌性R6-MEF中H3K27me3的免疫荧光染色结果显示,R6在一定程度上降低了该表观遗传修饰的印迹水平。3、流式细胞分选结果显示,野生型MEF细胞系中的GOF-GFP呈阴性,而R6-MEF细胞系中的GOF-GFP呈弱阳性。4、核型分析结果显示,R6-MEF细胞与野生型小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)的染色体均为40条,未见明显异常。综上所述,R6-MEF细胞系是介于野生型MEF细胞和多能性干细胞(比如诱导性多能干细胞)之间的一种新型细胞系,而这种细胞系的多能性远远弱于目前已建立的多能性干细胞。因此,该R6-MEF细胞系是一种更接近于野生型MEF细胞系的、可传50代次以上(以下称无限增殖)的新型细胞系。这种潜在的细胞特性为干细胞研究和动物育种模型的建立提供了新思路。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q23

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本文编号：1275307