家蚕DNA聚合酶δ复合物的表达、纯化和酶学特性分析

发布时间：2017-12-13 19:03

  本文关键词：家蚕DNA聚合酶δ复合物的表达、纯化和酶学特性分析

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【摘要】：作为鳞翅目类昆虫的代表,家蚕是研究农业及林业类害虫防治优先考虑的生物模型,也是研究动物细胞分化、生长、遗传和变异的重要模式生物之一。利用家蚕幼体作为一种生物反应器,可以低成本和大规模地获取外源蛋白。真核生物DNA聚合酶δ一般是多亚基蛋白复合物,例如高等哺乳动物DNA聚合酶δ多由四亚基组成,昆虫DNA聚合酶δ多由三亚基组成。真核生物DNA聚合酶δ是非常重要的复制型DNA聚合酶,具有持续合成DNA的能力,其3’-5’核酸外切酶活性保证复制的高保真度,并且在调节细胞正常代谢以及保证基因组完整性和稳定性等方面发挥重要的作用。本研究基于MultiBac系统表达家蚕DNA聚合酶δ复合物。通过与人(Homo sapiens)DNA聚合酶δ基因的生物信息学比对分析,从家蚕数据库(GenBank)中获取家蚕DNA聚合酶δ复合物三个亚基的基因序列。从家蚕五龄幼虫的血淋巴中提取总RNA,经RT-PCR反应得到cDNA。根据生物信息学比对分析结果设计引物并以cDNA为模板分别PCR得到三个亚基的基因,分别为Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3。然后分别制备pFast BacHTb-Bmpol-1和pUCDM-Bmpol-2/3两个重组质粒。辅助质粒pMon7124表达的转座酶介导pFastBacHTb-Bmpol-1和Bacmid在E.coli细胞内发生Tn7转座反应,通过蓝白斑筛选及抗性筛选得到Bcmid Bmpol-1重组受体。pBADZHis6Cre质粒表达的Cre重组酶介导pUCDM-Bmpol-2/3与Bacmid Bmpol-1在Cre-loxP位点发生特异性重组,得到Bacmid Bmpol-1/2/3重组质粒。将重组Bacmid质粒转染Sf-9细胞制备重组病毒。从感染的细胞中提取RNA,经RT-PCR反应检测到Bmpol-1、Bmpol-2及Bmpol-3基因在细胞内均发生转录。Western blot杂交实验表明,家蚕DNA聚合酶δ复合物BmPOL-1及BmPOL-3蛋白亚基均在Sf-9细胞中表达(目前还没有BmPOL-2蛋白亚基抗体,因此并未做BmPOL-2亚基Western blot杂交实验)。poly(d A)/oligo(dT)酶活性检测实验表明,单独的Bmpol-1大亚基不能催化合成DNA,而三亚基复合物能催化DNA合成,显示出酶学活性。使用Strep-Tactin和Ni2+-NTA亲和层析柱大量纯化得到家蚕DNA聚合酶δ复合物,质谱鉴定各亚基分子量分别为123.5 KDa(BmPOL-1)、49.1 KDa(Bm POL-2)和52.6 KDa(BmPOL-3)。至此,本研究通过使用MultiBac系统成功制备了具有酶学活性的家蚕DNA聚合酶δ复合物,使大量且快速获取家蚕DNA聚合酶δ复合物用于深入研究家蚕DNA复制以及DNA损伤修复成为可能。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;Q55

【参考文献】

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本文编号：1286215