产谷氨酰胺转胺酶的茂源链霉菌的基因转移育种研究

发布时间：2017-12-18 07:14

  本文关键词：产谷氨酰胺转胺酶的茂源链霉菌的基因转移育种研究

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【摘要】：谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,TGase,EC2.3.2.13)是目前应用非常广泛的一种食品添加剂,主要作用是使蛋白质发生交联,改变食品的质构。工业化生产TGase有着巨大的经济效益,目前工业生产中通常使用茂源链霉菌发酵的方法获得TGase(Microbial transglutaminase,简称MTG),这种方法具有价格低、周期短、纯化简便、且生产的MTG无Ca~(2+)离子依赖性等优势,但是也存在如菌株产量低、热稳定性差等问题,而获得性状优良的菌株是解决这些问题关键。本文改变传统诱变育种思路,通过基因转移的方法,以产MTG周期短、热稳定性高的菌株HS9和MTG产量高的菌株PoE为亲本菌株,尝试建立原生质体融合和Vector-free DNA电转两种方法,将两个系列菌株的基因整合到一个细胞中,使其发生重组,性状发生改变。通过高通量的筛选,最终成功获得一株产酶周期短、所产MTG热稳定性高,且产酶量能够达到工业化生产要求的菌株,并对其发酵性质和产酶热稳定性进行研究。主要的研究结果如下:(1)为选择基因转移的亲本菌株,并对接下来的基因转移实验奠定基础,对多轮多种诱变得到的突变菌株进行研究。菌株PoTX1通过诱变得到的突变株(Po系列菌株)中酶活最高的为PoE,达到8.65U/mL,比HS47诱变得到的突变株(HS系列菌株)更高,其中HS9酶活为4.43U/mL。HS系列菌株的产酶开始时间比Po系列提前12h,达到最高酶活时间提前18h。HS系列菌株所产MTG在温度为60℃时的反应效率更好,热稳定性更高。两个系列的菌株能从菌丝及单菌落形态、TG基因两方面区分。此外,Po系列菌株的细胞壁肽聚糖含量普遍比HS系列菌株低,且细胞壁糖类组分中含有葡萄糖,而HS系列菌株则没有。(2)在进行基因转移实验之前,需要对菌株的原生质体制备条件进行优化,获得高纯度、高形成率的原生质体。HS系列菌株的最优制备条件为:在YEME培养基中添加34%蔗糖和玻璃珠培养菌丝体,并添加1%甘氨酸提高细胞壁对溶菌酶的敏感性,菌丝体培养至36h,以6mg/mL溶菌酶酶解106/mL的菌丝体120min,以 Zn~(2+)、Fe3+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mo6+5 种微量元素复合添加在 P buffer 中作为缓冲液,最后500rpm离心去除未酶解的菌丝。Po系列菌株的制备条件基本一致,只有酶解时间缩短为60min,且用β-葡聚糖酶辅配溶菌酶酶解的差异。通过优化后的方法得到制备效果最好的菌株为HS9,原生质体纯度为98.87%,形成率为88.15%,以及菌株PoE,原生质体纯度为95.73%,形成率为91.27%,故选用这两个菌株作为接下来基因转移实验的亲本菌株。(3)原生质体融合是基因转移的一种方法。对HS9原生质体紫外灭活2min,对PoE原生质体热灭活40min,致死率都达到99%以上。使用50%的PEG-2000诱导灭活后106/mL的原生质体融合,融合率达到96.54%,再生出的菌落中融合子的比例为94.33%,证明双亲灭活法能够提高筛选融合子的比例。96孔板高通量筛选体系的变异系数小于20%,故设定酶活高于对照菌株酶活的20%为酶活提高,且发酵3d和4d的结果能够区别产酶时间,在37℃和60℃测量酶活的结果可以区别热稳定性。初筛中同时拥有产酶提高、产酶时间早、热稳定性好三种性状的菌株所占比例为6.79%,每一批次平均酶活提高比例在1.62%-12.93%之间,疑似高产菌株比例范围在20.65%-29.86%。(4)Vector-free DNA电转是基因转移的另一种方法。通过XhoⅠ、EcoRI将全基因组DNA切割,将产红色色素的菌株M52的DNA电转入HS9的原生质体中验证电转成功,并以有色菌株数量计算转化效率。电转的最适受体细胞为HS9的原生质体,最适电压为1.5kV,最适复苏时间为120min,得到的转化效率为33.8×104CFU/μg。电击对菌株本身的发酵产酶没有影响,初筛中同时拥有产酶提高、产酶时间早、热稳定性好三种性状的菌株所占比例为11.92%,每一批次平均酶活提高比例在8.83%-18.10%之间,疑似高产菌株比例范围在26.41%-37.08%,高于原生质体融合得到的比例。(5)对两种基因转移方法筛选得到的菌株进行验证,vector-free DNA电转获得的高产菌株中,酶活高于HS9的菌株占比100%,高于PoE的占比56%,产酶较早的占比89%,所产MTG热稳定性好的占比70%,都高于原生质体融合获得的菌株比例。其中DZ10产酶8.06U/mL,相比HS9提高76.75%,且整体发酵情况和亲本菌株中的HS9类似,酶活达到最高点的时间比PoE提前20h,可以缩短生产周期,降低生产成本。DZ10所产MTG的最适反应温度为55℃,具有热稳定性好的优势。综上,本文建立了茂源链霉菌原生质体融合以及vector-free DNA电转两种基因转移育种方法,通过基因转移和重组,以提高谷氨酰胺转胺酶的产量,获得发酵性质和酶性状更优良的菌株。经过高通量筛选,我们获得产酶高、产酶周期短、所产MTG热稳定性好的菌株DZ10,对其发酵性质和热稳定性进行分析,为其以应用于工业生产MTG奠定基础。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93

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本文编号：1303286