Pseudomonas donghuensis HYS对Caenorhabditis elegans毒性作用的初步探究

发布时间：2017-12-19 12:25

  本文关键词：Pseudomonas donghuensis HYS对Caenorhabditis elegans毒性作用的初步探究　出处：《武汉大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：实验室前期工作中发现一株从东湖水域分离出的高产铁载体的菌株,进行全基因组测序并定为假单胞菌属,命名为Pseudomonas donghuensis HYS~T。假单胞菌与宿主之间的相互作用关系已有大量研究报道,其中,秀丽隐杆线虫作为一种模式生物,被大量运用于相互作用关系的研究中。假单胞菌对秀丽隐杆线虫的毒性致死作用模型基本分为两种,一种是慢性致死作用模型,一种是急性致死作用模型。据已有文献报道,在慢性致死作用模型中,铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫具有毒性作用,通过实验证明Pseudomonas dongyuensis HYS~T 对秀丽隐杆线虫的毒性作用更为明显。为了探究Pseuddomonas donghuensis HYS~T对秀丽隐杆线虫的毒性作用机制,采取构建菌株的全基因组转座子插入突变库的方法,筛选功能基因。利用慢性致死作用模型对具有减毒性状的突变株进行筛选,通过初筛复筛得到性状稳定的减毒突变株,然后利用Tail-PCR、半随机引物PCR法进行转座子侧翼序列的调取,从而得到相关的功能基因。通过两轮筛选后鉴定出来15个基因。在筛选出的基因中,位于基因组Scaffold 15 32640-32641处的基因enoly-CoA hydratase已筛到6次,并且与已报道的铜绿假单胞菌中对秀丽隐杆线虫有毒性作用的PA0745有较高同源性,该基因引起重视,构建该基因的敲除菌株和回补菌株判断它对于秀丽隐杆线虫的毒性功能。通过NCBI分析其基因功能,也可看出该基因具有水合酶活性且参与脂肪酸代谢,利用酶活反应体系进行基因功能的鉴定,通过分析敲除株与野生型脂肪酸含量的差异对其参与的代谢途径进行验证。实验结果表明该基因编码蛋白具有水合酶活性且参与脂肪酸代谢。分析该基因的上下游序列,发现上游4个基因位置关系排列紧密,猜想为一个基因簇并通过共转录检测得以验证。另外,将最上游基因进行敲除后发现敲除株具有减毒作用。此外,筛选到了两个基因 NAD dependent epimerase和polyketi 和 cyclase,分别位于基因组 Scaffold 14 105154-105155、Scaffold 14 107680-107681 上,这两个基因排列紧密,猜测位于同一个基因簇上,于是将这两个基因的上下游基因调取出来,观察排布,进行共转录检测。检测结果表明这些基因均共转录,位于同一个基因簇上。将基因NADdependent epimerase敲除后,菌株对秀丽隐杆线虫的毒性明显减弱,说明该基因对秀丽隐杆线虫具有毒性作用。但该基因簇具体对秀丽隐杆线虫的作用,以及这两个基因间的相互关系仍需进一步探索。综上所述,本研究通过构建菌株的插入突变库并利用慢性致死作用模型初步探究了Pseudomonas donghuensis HYS~T对秀丽隐杆线虫的毒性作用机制。重点探究了筛选得到的两个基因 enoly-CoA hydratase,NAD dependent epimerase以及所在基因簇对秀丽隐杆线虫的毒性作用,并推测产生毒性的原因。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q93

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本文编号：1307973