TBC1D15的Rab-GAP活性研究及其进化特点分析

发布时间：2017-12-19 12:34

  本文关键词：TBC1D15的Rab-GAP活性研究及其进化特点分析　出处：《浙江理工大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：TBC1D15(TBC domain family,member 15)蛋白在物种间具有一个高度保守的TBC域(TBC domain),且影响其活性的关键精氨酸残基位点也高度保守。已有研究表明在小鼠及人中的TBC1D15与其他含有TBC domain的蛋白家族成员相似,都具有Rab-GAP活性,但鲨鱼中的TBC1D15研究较少,更未见对TBC1D15的Rab-GAP特异性的演变过程及关键氨基酸的改变对其Rab-GAP活性影响的相关研究。本研究选择了鲨鱼(Shark),猪(Sus),鼠(Mus),人(Homo)几种不同物种的TBC1D15基因进行原核表达及其重组产物纯化,结果发现TBC1D15全长蛋白表达量低,尤其是鲨鱼中的TBC1D15容易断裂,得不到稳定的全长蛋白。将这四种物种的TBC1D15蛋白序列截短,得到不同物种的GAP(GTPase activating protein)蛋白截短序列,即决定TBC1D15蛋白Rab-GAP活性的关键序列。利用序列比对软件对Shark,Sus,Mus,Homo的TBC1D15-GAP氨基酸序列进行比对,分析其序列保守性。结果发现有五个位点的精氨酸残基在物种Sus,Mus,Homo中均高度保守,但在Shark-TBC1D15-GAP中这五个位点分别由G28、K45、K119、K122、K221氨基酸残基替代。将Shark-TBC1D15-GAP中的五个不同氨基酸残基全部突变为精氨酸残基,并将其他物种GAP中的该位点的精氨酸残基全部突变为对应鲨鱼中的G28、K45、K119、K122、K221氨基酸残基,通过研究不同物种TBC1D15-GAP突变前后Rab-GAP特异性的规律变化,分析这些氨基酸位点与TBC1D15进化是否存在关联。对四种物种的TBC1D15全长及GAP氨基酸序列进行进化树分析发现,无论对于全长还是对GAP,物种Mus和Homo的亲缘关系较近,Shark与Sus以及Sus和Homo相互之间的亲缘关系较远。故选择相互间亲缘关系较远的Shark,Sus,Homo三个代表性物种的TBC1D15-GAP进行氨基酸突变及Rab-GAP特异性分析。将Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突变体基因构建至pETduet-his-sumo载体上并原核表达纯化。同时表达纯化不同的底物Rab(Rab4/5/7/11)蛋白并浓缩,分别与Shark/Sus/Homo-TBC1B15-GAP及其突变体蛋白反应。首先进行了动力学实验,比较不同GAP蛋白催化Rab4/5/7/11蛋白水解GTP的速率,分析不同物种TBC1D15-GAP的Rab-GAP活性差异。结果发现,不同物种的TBC1D15-GAP在特定氨基酸位点突变之后,Rab-GAP活性有一定的变化。Shark-TBC1D15-GAP在将五个氨基酸位点G28、K45、K119、K122、K221同时突变为精氨酸残基之后,与野生型Sus-TBC1D15-GA的Rab-GAP活性情况相似。且Homo-TBC1D15-GAP在将五个精氨酸同时突变为对应于Shark-TBC1D15-GAP中的氨基酸残基后也与野生型Sus-TBC1D15-GAP活性情况相似。以上结果初步表明这些特定氨基酸位点对TBC1D15的Rab-GAP活性具有一定的影响。进一步对六种GAP蛋白进行了Rab-GAP特异性分析,通过求水解过程中的kcat/Km,比较催化效率来判断所突变氨基酸位点对不同物种GAP蛋白的活性影响。结果发现,物种Sus和Homo的野生型GAP均对Rab11表现出最大的底物偏爱性,且对Rab11/5/4/7的催化效率依次由高到低,而Shark-TBC1D15-GAP野生型对Rab5具有较大的底物偏爱性,将氨基酸残基G28、K45、K119、K122、K221都突变为精氨酸残基后,也对Rab11有最大的底物偏爱性,与野生型Sus-TBC1D15-GAP,Homo-TBC1D15-GAP活性情况类似。进一步表明这些氨基酸残基可能与TBC1D15的物种进化有关。本课题通过对不同物种TBC1D15-GAP及其突变体蛋白进行Rab-GAP动力学分析及特异性分析,初步验证了TBC1D15保守域中的五个特定氨基酸残基可能是TBC1D15进化过程中的关键氨基酸残基。随着物种的不断进化,TBC1D15-GAP的底物专一性逐渐偏向Rab11,推测可能与物种进化中对环境适应能力不断提高有关。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q51

【参考文献】

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本文编号：1308006