可降解大米生淀粉的α-淀粉酶AmyP的结构和功能关系

发布时间：2017-12-21 15:41

  本文关键词：可降解大米生淀粉的α-淀粉酶AmyP的结构和功能关系　出处：《安徽大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可作用于淀粉、多糖及寡糖内部的α-1,4-葡萄糖苷键,产生α-异头物构型保留的低聚麦芽糖和葡糖糖。α-淀粉酶在淀粉转换成低聚糖的过程中起着非常重要的作用,因此对于以淀粉作为基本能量来源的有机体来说是至关重要的。另外,α-淀粉酶在食品、发酵、制药以及生物燃料等工业领域也得到了广泛的应用。在根据蛋白质的序列同源性分类的CAZy数据库中,GH13家族被认为是最主要的α-淀粉酶家族,与GH70和GH77家族共同形成了具有(β/α)8(或称TIM)桶式折叠催化结构域的GH-H宗族。GH13家族α-淀粉酶具有4-7个保守的序列区,包括了 Asp-Glu-Asp的催化三联体和重要的底物结合位点,且都实行保留催化机制。根据序列相似性的程度,目前在CAZy数据库上将GH13家族分成了42个亚家族。α-淀粉酶分布于其中的11个亚家族当中,其中GH13_37亚家族是最新建立的。它的建立是基于从海洋宏基因组文库中筛选到的一个新颖的细菌α-淀粉酶AmyP。AmyP能快速偏好降解大米生淀粉,水解淀粉的终产物由葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖组成。AmyP由N-末端的催化结构域和C-末端的淀粉结合结构域SBD组成。目前为止,GH13_37亚家族除了AmyP,还包括56个假定的成员,这些成员大多数来自海洋细菌。为了更好地认识这个新的亚家族,我们解析了AmyP催化结构域酶活缺失突变体AmyP△SBD-E221Q与麦芽三糖复合物的晶体结构,Glu221是酶的三个保守催化位点中的一个。然后基于结构分析构建了不同的突变体进行了相应的生化和酶学实验验证。AmyP△SBD的结构与其他GH13家族αα-淀粉酶的结构相似,由3个结构域组成,分别是domain A,domain B和domain C。Domain A是典型的包含催化位点的(β/α)8桶结构,domain C是由反平行的八股β-折叠片组成,而domain B是目前已报道的GH13家族α-淀粉酶中最短的,形成一段从domain A伸出的loop,没有通常位于domain A和domain B之间的钙离子结合位点。这样一个小的domain B使AmyP△SBD相比其它GH13家族α-淀粉酶呈现一个更开放的底物结合口袋,利于生淀粉颗粒表面的接近和生淀粉的水解。Domain B紧邻活性中心,同样有助于稳固AmyP△SBD活性位点的构象和增强酶的热稳定性。另外,四个半胱氨酸残基两两形成二硫键(Cys2-Cys243和Cys359-Cys365),位于domain A中,这在GH13_37亚家族中是保守的。大多数GH13家族α-淀粉酶在domain A和domain B结构域的界面间存在保守的钙离子结合位点,参与酶分子结构的稳定,增强其活性和热稳定性。而AmyP△SBD在Domain A边缘有两个钙离子结合位点,其中一个很新颖,靠近-3糖单元结合位点。因此,钙离子的结合有助于增强酶的热稳定性。此外,在底物结合-3亚位点,酶的Tyr36残基与-3糖单元形成疏水和氢键相互作用,这与在水解淀粉的初期,野生型主要产生麦芽三糖,而Y36A突变体主要产生麦芽糖的结果是完全吻合的。我们的工作第一次对这个GH13新亚家族GH13_37提出了结构上的见解,也是第一个对可降解生淀粉的细菌来源的α-淀粉酶的结构描述,为更适合工业应用的淀粉酶的定向改造提供了理论基础。
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 汪颖;刘源涛;郑昀昀;彭惠;;α-淀粉酶AmyP中淀粉结合结构域的鉴定[J];微生物学通报;2013年12期

2 李兰芬;南洁;苏晓东;;蛋白质晶体学技术的发展与展望[J];生物物理学报;2007年04期

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本文编号：1316270