基于CRISPR-Cas9系统的谷氨酸棒状杆菌基因组编辑技术的研究
本文关键词：基于CRISPR-Cas9系统的谷氨酸棒状杆菌基因组编辑技术的研究 出处：《山东大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：谷氨酸棒状杆菌被广泛应用于大规模生产氨基酸、重要有机酸和生物能源等,是一种高价值的模式菌株。随着代谢工程的快速发展以及全基因组测序技术的普及,利用基因工程手段改造谷氨酸棒状杆菌受到越来越多研究者的重视,基因编辑技术作为有效的基因改造工具,其开发和应用也进一步加快了合成生物学和基因组学的发展。以CRISPR-Cas9、单链重组等为代表的高效的基因编辑技术,通过在基因组水平上对DNA序列进行定点修饰和遗传改造,能够实现基因表达调控、代谢途径改造的目的。本论文旨在开发适用于谷氨酸棒状杆菌的基因组编辑工具,以研究报道中应用比较广泛的CRISPR-Cas9技术为基础,选取非同源末端连接(NHEJ)修复系统以及单链重组系统两个案例进行了初步应用探究。主要研究结果分两个部分,第一部分是在谷氨酸棒状杆菌中探索了 CRISPR-Cas9结合NHEJ(CA-NHEJ)进行一步删除基因的应用。首先是对CRISPR-Cas9系统进行功能验证,通过在表达该系统的质粒上设计靶位点,构建验证载体pECXK99E-Cas9-ffl,将其转入到野生型的谷氨酸棒状杆菌中。通过使用IPTG诱导Cas9蛋白表达,验证了CRISPR-Cas9可以有效发挥定点切割功能。然后结合NHEJ系统,构建表达载体pXMJ19-NHEJ,对酶切产生的线性化质粒双链断裂(DSB)进行修复,实验结果表明该系统不仅可以有效修复DSB并伴随着基因缺失,与此同时还发现在谷氨酸棒状杆菌可能存在内源修复系统,可以保真性修复外源线性片段DSB。在验证了以上两个系统都能有效发挥功能的情况下,期望利用CA-NHEJ进行基因组目的片段的删除,但是可能由于表达强度不够或内源保真修复系统的干扰,没能达到理想的效果,该技术的实现还需进一步的研究。本论文的第二部分是借助于CRISPR-Cas9产生DSB的能力,进行突变重组子的筛选。根据多元重组(MAGE)的设计理念,本研究旨在利用人工合成单链DNA(ssDNA)调控谷氨酸棒状杆菌目的基因的表达。首先,构建表达单链重组蛋白的载体pXMJ19-RecT,比较了不同来源重组蛋白的效率并择优选择,通过利用标记基因对多个位点的碱基同义突变进行验证,证明了单链重组技术的可操作性。然后针对选择的靶位点合成75 nt大小的ssDNA,在单链突变的地方设计spacer位点,构建载体pECXK99ES-Cas9-32k。通过采取前期诱导重组酶的表达,然后共转化ssDNA与筛选质粒的策略,在完成单链重组后进行突变重组子的筛选。最后,通过平板抗性比较及测序验证,统计筛选出来的重组子正确率约为60%。同时我们还对CRISPR-Cas9表达载体的构建方法进行了设计优化,借鉴Gloden Gate Assembly的方法连接单个向导RNA(sgRNA)位点,以便更高效、快速的完成筛选工作,在能有效改变基因组基因序列的同时提高了工作效率。基于现在的研究热点,本研究结合CRISPR-Cas9与单链重组技术在谷氨酸棒状杆菌中成功建立了一个快速、高效、可循环的基因组编辑技术,为在基因组上进行快速的代谢途径优化提供了一组有价值的遗传操作工具。虽然CA-NHEJ系统介导基因组DSB修复结果不太理想,相信通过进一步的探索会得到更为理想的效果。此外,我们在研究中也发现了谷氨酸棒状杆菌内源存在的保真修复系统,为接下来的工作提供了理论平台。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
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，本文编号：1331766
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