大肠杆菌DsrA-sRNA和oriC转录对DNA复制起始的影响

发布时间：2018-01-06 19:09

  本文关键词：大肠杆菌DsrA-sRNA和oriC转录对DNA复制起始的影响　出处：《内蒙古大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：细菌sRNA(small noncoding RNA)广泛参与细菌生命活动,包括基因表达、代谢以及应激反应,但仍未见sRNA对DNA复制起始影响的系统研究。经过敲除11种sRNA并分析所得突变体,发现大肠杆菌DsrA-sRNA影响DNA复制起始,是个复制起始负调控因子。DsrA-sRNA与dnaA-mRNA可能有相互作用,但这种相互作用并未影响DnaA的表达。然而,qPCR实验说明DsrA-sRNA过表达提升rpoS、dps、hchA、cbpA和yiaG基因的表达,敲除dsrd降低dps基因的表达,而Dps的表达会阻止DNA复制起始。另外,细菌双杂交实验证实HchA与Dps蛋白有相互作用,而HchA与DnaA蛋白没有相互作用。有趣的是,△dps细胞中过表达DsrA-sRNA促进DNA复制起始,与在野生型细胞中过表达DsrA-sRNA的效果相反。△hchA细胞中过表达DsrA-sRNA仍然抑制复制起始。综上所述,DsrA-sRNA对复制起始的抑制作用是通过Dps来实现的,然而,缺失Dps时,DsrA-sRNA以别的途径影响复制起始。复制原点附近基因穿越oriC的转录是复制起始必须的。为了探讨oriC转录对复制起始的作用机制,把PBAD启动子插入在染色体oriC右侧,其转录能够穿越oriC,构建了 WT-PBAD、△dksA-PBAD和△mfd-PBAD菌株。经流式细胞仪分析发现阿拉伯糖的加入并不影响WT-PBAD细胞的复制起始;阿拉伯糖诱导对△dksA-PBAD细胞的复制起始的影响依赖于营养,在LB培养基中AdksA-PBAD细胞的复制起始频率明显高于△dksA细胞,阿拉伯糖的加入进一步提高其复制起始频率。因此,oriC转录的确促进染色体复制起始,但其作用由DksA活性来调节。
[Abstract]:Bacterial sRNA(small noncoding is widely involved in bacterial life activities, including gene expression, metabolism and stress response. However, there was no systematic study on the effect of sRNA on the replication initiation of DNA. After knockout of 11 sRNA and analysis of the mutants obtained, it was found that Escherichia coli DsrA-sRNA affected the replication initiation of DNA. DsrA-sRNA may interact with dnaA-mRNA, but this interaction does not affect the expression of DnaA. QPCR assay showed that overexpression of DsrA-sRNA enhanced the expression of rpoSdpshchAhbpA and yiaG genes, and knockout dsrd decreased the expression of dps gene. The expression of Dps prevents the initiation of DNA replication. In addition, bacterial two-hybrid studies show that HchA interacts with Dps protein, while HchA does not interact with DnaA protein. Interestingly. Overexpression of DsrA-sRNA in dps cells promotes the initiation of DNA replication. In contrast to overexpression of DsrA-sRNA in wild-type cells, overexpression of DsrA-sRNA in hchA cells still inhibited replication initiation. The inhibitory effect of DsrA-sRNA on replication initiation is achieved through Dps, however, when Dps is missing. DsrA-sRNA affects replication initiation in other ways. The transcriptional translocation of oriC in the vicinity of replication origin is necessary for replication initiation. In order to investigate the mechanism of oriC transcription on replication initiation. The PBAD promoter was inserted into the right side of chromosome oriC and its transcription was able to traverse oric to construct WT-PBAD. DksA-PBAD and mfd-PBAD strains. Flow cytometry analysis showed that arabinose did not affect the replication of WT-PBAD cells. The effect of arabinose induction on replication initiation of dksA-PBAD cells is dependent on nutrition. The replication initiation frequency of AdksA-PBAD cells in LB medium was significantly higher than that of dksA cells, and arabinose increased the replication initiation frequency. OriC transcription does promote the initiation of chromosome replication, but its effect is regulated by DksA activity.
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q75

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本文编号：1389139