Junctophilin-2对小鼠心肌细胞SK2通道与RyR2功能耦联的影响

发布时间：2018-04-08 11:52

  本文选题：Junctophilin　切入点：2　出处：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：1研究背景与目的:JPH2基因编码的Junctophilin-2是心脏Junctophilins(JPs,JPHs)家族中参与形成膜耦联复合体的蛋白成员,是与心肌细胞内Ca~(2+)信号操纵相关的蛋白分子。已有研究表明,小鼠JPH2敲除会导致其胚胎期致死,心脏出现不规则钙信号,以及与SR钙释放分离的异常收缩。表明JPH2在促进SR钙释放和心肌收缩中起着关键作用。在心肌肥大模型中,JPH2表达的下调与L-型Ca~(2+)通道和RyR2之间的耦联缺陷有关。提示JPH2可能与细胞膜上电压门控钙离子通道和肌浆网膜ryanodine受体之间的功能耦联有关。小电导-Ca~(2+)-激活K~+通道(small-conductance calcium-activated potassium channel SK,Kca2)属于非电压依赖性,几乎可表达在所有可兴奋细胞。根据对特异性阻断剂apamin敏感性的不同,SK通道可以被分为SK1,SK2,SK3和SK4四种亚型。SK1一般存在于神经组织中,SK2和SK3既存在于神经组织也存在于外周组织。作为钙激活的钾通道,心肌细胞上的SK2通道对胞浆中的钙离子具有高度敏感性,可通过细胞内低钙离子浓度而被激活,从而整合Ca~(2+)浓度和膜电位的变化。细胞内Ca~(2+)来源主要包括两条途径:通过电压门控Ca~(2+)通道(voltage-gated Ca~(2+)channels,VGCCs)激活从细胞外进入细胞内的Ca~(2+)及通过心肌肌质网(sarcoplasmic,SR)膜上的兰尼碱受体(ryanodine receptors,RyRs)激活释放储存的Ca~(2+)。之前,我们实验室已经论证了心肌RyR2敏感的Ca~(2+)释放通道可以调控心肌SK2通道介导的Ca~(2+)激活K~+(Ik,Ca)电流,但对RyR2和SK2通道之间功能耦合的具体分子机制并不清楚。JPH2是否是心肌SK2通道与RyR2之间膜耦联的关键分子,目前尚不清楚。本实验通过RNA干扰JPH2基因,并利用腺病毒介导构建Ad-JPH2-RNAi重组载体,转染新生小鼠心肌细胞,采用全细胞膜片钳研究了JPH2对SK2通道介导的Ik,Ca电流的影响。通过给予RyR2激动剂-Caffeine,RyR2抑制剂-Ryanodine,以及SR Ca~(2+)ATP酶抑制剂-Thapsigargin,观察JPH2对心肌RyR2钙释放通道与SK2通道功能性耦联的影响。从而为揭示心脏SK通道分子调控、心脏疾病的预防策略提供可靠的实验依据。2材料方法:1)本实验采用出生1-3天的C57BL/6小鼠(合格证号为SCXX(京)2012-0001),购于北京维通利华实验动物技术有限公司,雌雄不限。2)用实验室已成功制备的JPH2-shRNA重组腺病毒表达载体转染原代培养的小鼠心肌细胞,将细胞分为3组:正常未转染病毒的对照组(Ctrl-NC);转染无关序列腺病毒(Ad-scramble siRNA)对照组;转染JPH2siRNA序列腺病毒(Ad-JPH2-siRNA)组。3)采用Real-time PCR检测各组细胞提取的cDNA样本中JPH2 mRNA相对量。4)采用全细胞膜片钳记录感染心肌细胞SK2通道介导的Ca~(2+)-激活K~+电流(calcium-activated potassium current,Ik,Ca)的变化。将细胞分为3组:Ctrl-NC,Ad-scramble si RNA和Ad-JPH2-si RNA组。为探讨JPH2在SK通道与RyR2功能耦联中的作用,又将细胞分为4组:Ad-scramble siRNA,Ad-JPH2-siRNA,Ad-JPH2-siRNA+Ryanodine+TG以及Ad-JPH2-siRNA+Caffeine组。5)统计学分析:利用统计软件SPSS 17.0进行实验数据的统计和处理。采用单因素方差分析比较各组间的显著性差异。以α=0.05为检验水准,n表示样本例数。3结果:1)采用Real-time PCR检测各组心肌细胞JPH2 mRNA相对表达量。结果显示:与Ctrl-NC组细胞相比较,Ad-scramble siRNA组心肌细胞JPH2 mRNA水平无显著性差异;Ad-JPH2-siRNA组JPH2 mRNA的相对表达水平与对照组细胞相比较,显著降低,其干扰效率达到80-90%。2)用全细胞膜片钳法记录Ik,Ca电流结果显示:与Ctrl-NC和Ad-scramble siRNA组相比,Ad-JPH2-siRNA组心肌细胞膜SK2通道Ik,Ca电流显著减小;预先给予RyR2受体抑制剂Ryanodine+TG,与Ad-scramble siRNA组相比较,SK2通道介导的Ik,Ca电流被明显抑制;与Ad-JPH2-siRNA组比较,Ik,Ca电流有减小的趋势,但组间差异无显著性。给予RyR2受体激动剂Caffeine,与Ad-scramble siRNA组相比较,Ik,Ca电流显著减小,与Ad-JPH2-siRNA组比较,Ik,Ca电流增大。4小结siRNA敲减小鼠心肌细胞JPH2可显著抑制心肌细胞JPH2 mRNA的表达,抑制SK2通道Ik,Ca电流;JPH2可通过RyR2 Ca~(2+)释放通道调节SK2通道介导的Ik,Ca。提示JPH2介导了心肌SK2通道和RyR2之间的功能耦联。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q25

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本文编号：1721480