大豆抗盐蛋白PM18互作蛋白的筛选及分析

发布时间：2018-04-17 22:28

本文选题：大豆 + PM18　；参考：《深圳大学》2017年硕士论文

【摘要】：固有无序蛋白是一类在天然状态下没有稳定的二级或三级结构,局部或整体不发生折叠,但依旧可以行使正常生物学功能的一类蛋白质。这类蛋白参与多种生理过程,可通过与蛋白质、核酸、脂类、金属离子及小分子等多种分子结合,在分子调控网络中发挥多种功能,也可在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用,因此IDPs在提高作物抗逆性中具有潜在应用价值。LEA蛋白是一类典型的固有无序蛋白,可被低温、干旱、高盐等非生物胁迫诱导表达。在胁迫条件下,LEA蛋白具有维持蛋白活性、抑制蛋白发生聚集、稳定蛋白构象及保护膜结构等多种功能。目前已有大量转基因实验证实第3组LEA蛋白在植物体中的过表达可以提高宿主植物的抗逆性。大豆PM18蛋白属于第3组LEA蛋白,我们实验室前期研究发现已有研究发现该基因可以提高大肠杆菌、酵母及拟南芥的耐盐性,但发挥作用的机制尚未见报道。由于固有无序蛋白的无序特性使其在分子网络中经常通过与不同结构的靶蛋白发生结合,参与不同生理过程从而发挥作用,所以我们推测其可与其他蛋白质发生相互作用在植物抵抗逆境胁迫时发挥保护功能。因此,我们以筛选大豆耐盐蛋白PM18的互作蛋白作为切入点,以进一步揭示LEA蛋白的耐盐机制。为了进一步探究PM18蛋白的耐盐机制,首先采用生物信息学的方法预测对PM18蛋白进行预测,利用在线网站STRING对其互作蛋白进行预测,结果显示大豆PM30和PM32蛋白和大豆PM18蛋白最有可能存在相互作用关系。通过PSORT Ⅱ和Plant-PLoc对PM18蛋白进行亚细胞定位,预测结果显示位于细胞核,同时利用三种不同软件metaPrDOS、DISOPRED和IUPred对PM18蛋白的无序程度作出预测,结果发现PM18蛋白的N端(0-30位)及C端(300-309位)呈现出很强的无序性,其含有8个保守结构域的区域(113-205位)应为有序结构。然后选用200mMNaCl高盐胁迫后大豆的根和叶为材料,采用SMART法构建大豆cDNA文库,片段化检测结果显示插入的片段大小在0.5～5.0Kbp之间,平均为1000bp,滴定检测的滴度为4×104cfu/ml,文库质量较好,符合后期酵母双杂交的实验需求。然后,通过PCR方法从大豆cDNA中克隆出PM18基因,经测序鉴定无误后,成功构于载体PGBKT7。将pGBKT7-PM18和pGADT7质粒共转化至酵母菌株AH109中,检测诱饵蛋白不存在自激活现象,可以利用酵母双杂交系统进行筛选且筛库不需要添加3AT。最后利用酵母双杂交系统进行筛选,将pGBKT7-PM18的质粒与大豆cDNA文库的质粒共转至酵母菌株AH109,筛选23个阳性克隆,回转验证后得到17个有效的阳性克隆,经测序分析共有6个读码框正确且位于CDS内的基因片段,通过NCBI对基因序列片段进行查找,全长序列分别为 LOC100170728,MYB173,LOC100499708,LOC100306286,LOC100500540,LOC100038325。利用在线网站对得到的6个蛋白的基本信息及氨基酸序列进行分析,通过PCR方法从大豆cDNA中成功得到5个基因片段的全长序列,并成功构建于PGADT7载体上,再次采用回转验证的方法,将其分别与pGBKT7-PM18共转至酵母菌中,结果显示大豆LOC100170728和MYB173所编码的蛋白与大豆抗盐蛋白蛋白可能存在相互作用关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q946

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