化脓性链球菌溶血素O和人视黄醇结合蛋白的表达与纯化

发布时间：2016-11-18 08:35

  本文关键词：化脓性链球菌溶血素O和人视黄醇结合蛋白的表达与纯化，由笔耕文化传播整理发布。

《南京师范大学》 2015年

化脓性链球菌溶血素O和人视黄醇结合蛋白的表达与纯化

齐亚坤  

【摘要】：目前,表达外源基因时一般会首先选择大肠杆菌表达系统,但是外源基因在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中高效表达时容易形成包涵体。本文选取两种不同来源的基因,尝试从不同的方面去解决它们在宿主菌中高效表达时形成包涵体的问题。化脓性链球菌溶血素O (Streptolysin O, SLO)是含-SH基的蛋白质,对红细胞等多种细胞有损伤作用,有较强的抗原性,能引起咽炎、风湿热及急性肾小球肾炎等疾病。本文从化脓性链球菌中克隆编码SLO的基因,去掉了N端70个氨基酸长度的碱基序列,在热激表达载体pHsh中,重组蛋白SLO的表达量较低并且大部分在沉淀当中,降低诱导温度和设置不同的诱导时间后,表达量低和形成包涵体的问题没有明显改善。在冷激表达载体pEXC中,重组蛋白SLO的表达量明显提高,同时全部是可溶性表达。接着对重组蛋白SLO的表达进行了一系列的表达优化：首先是选取不同的表达宿主,在四种表达宿主Ecoli DH10B、Ecoli JM109。E.coli BL21、 E.coli TOP10中分别进行表达,SDS-PAGE分析发现在Ecoli BL21中重组蛋白的表达量最高；其次是N端二级结构优化,软件预测发现核糖体结合位点和翻译起始位点均形成了发卡结构,通过基因定点诱变解开发卡结构,但是经过SDS-PAGE分析发现重组蛋白的表达量并没有明显提高；最后是稀有密码子的优化,对编码SLO的基因进行软件预测,发现对于宿主大肠杆菌,基因序列共有20处密码子偏好性较低,选取两处进行同义突变,经过SDS-PAGE分析发现重组蛋白的表达量并没有明显提高。经Ni亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化后,纯化得到SLO的产量约18 mg(1 L的LB培养基中),Western Blot分析,发现纯化的重组SLO蛋白与小鼠抗6×His抗体有很高的特异性反应,,同时对纯化蛋白进行溶血活性分析,发现SLO终浓度为80 ng/mL时能完全溶血。人视黄醇结合蛋白(Retinal binding protein, RBP)是一种疏水性的小分子结合蛋白,在检测肾脏和肝脏相关方面的疾病有很重要的指示作用。本文主要通过构建四种不同的大肠杆菌表达质粒pHsh-rbp、pHsh-ex-rbp、pEXC-rbp、 pTrc99a-rbp和一种粟酒裂殖酵母表达质粒peno-GFAT-cpy-rbp,在大肠杆菌中运用了热激、冷激、分泌型、IPTG四种不同的表达方式,并在各自表达条件下设置一系列的温度、诱导时间及诱导起始OD梯度变化,但是这些方式对重组蛋白RBP的可溶性表达并没有明显的促进作用。重组蛋白RBP在粟酒裂殖酵母中实现了可溶性的分泌型表达,但是重组蛋白只在EMM培养基中表达,在YES培养基中不表达,对重组蛋白的表达进行稀有密码子优化和诱导时间优化,发现稀有密码子优化对重组蛋白的表达量没有明显的提高,而重组RBP在粟酒裂殖酵母生长到稳定期的中后期时候表达量较高。分别对大肠杆菌中冷激诱导表达的RBP和粟酒裂殖酵母中分泌表达的RBP进行纯化,最后在1L各自的培养基中得到了约8 mg和10 mg的重组蛋白RBP,分别用鼠抗6×His抗体进行Western Blot分析,两种方式得到的蛋白均能和抗体发生特异性反应。

【关键词】：
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

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