家蚕滞育激素DH及其受体DHR1的转基因过表达研究

发布时间：2018-06-03 14:49

本文选题：家蚕 + 滞育　；参考：《西南大学》2017年硕士论文

【摘要】：滞育是昆虫为适应不良环境而形成的一种在卵、幼虫、蛹或成虫期发育停滞的生理现象,对昆虫生存和繁殖具有重要意义。鳞翅目模式昆虫家蚕是卵滞育的典型代表,但其滞育的分子机制仍未彻底阐明。研究表明,家蚕咽下神经节分泌的滞育激素(diapause hormone,DH)是诱导蚕卵滞育的主要因素,DH通过滞育激素受体(diapause hormone receptor,DHR)传递信号并最终决定卵的滞育。加强DH和DHR的功能及作用机制研究,有助加深我们对家蚕卵滞育机制的了解,并为家蚕育种和卵滞育害虫防控提供理论参考。有关家蚕滞育的分子生物学研究,主要集中在相关基因的鉴定、表达和生理生化分析等方面,鲜有基于转基因技术的研究报道。本论文以DH及其受体DHR1为靶标,利用转基因技术和GAL4/UAS双元表达工具,在多化性家蚕品系Nistari(Nis)中过表达DH和DHR1基因,研究它们对多化性家蚕胚胎滞育的影响,取得的主要结果如下:1.DH和DHR1基因的鉴定及克隆从家蚕中鉴定并克隆了DH和DHR1基因的CDS序列。测序结果表明:DH基因CDS序列长579 bp,编码192个氨基酸,编码蛋白含有1个跨膜结构域;DHR1基因CDS序列全长1311 bp,编码436个氨基酸,含有7个跨膜结构域。2.DH和DHR1基础转基因系的制作构建了用于过表达DH和DHR1基因的piggyBac表达载体pB[A4-GAL4,3×P3DsRed]、pB[UASDH,3×P3EGFP]和pB[UASDHR1,3×P3EGFP]。将该3个载体质粒显微注射至Nis早期胚胎,通过荧光筛选获得了相应的G1代阳性蛾圈,分别命名为A4G4、UASDH和UASDHR1。经反向PCR和基因组PCR方法检测确认,3个基础转基因系制作成功。3.过表达DH和DHR1转基因系的制作将A4G4转基因系分别与UASDH和UASDHR1转基因系杂交,通过对杂交后代个体进行双荧光筛选,获得了过表达DH和DHR1的阳性杂交后代,分别命名为A4G4/UASDH和A4G4/UASDHR1。qRT-PCR检测结果显示,DH和DHR1基因均显著上调表达,表明转基因过表达系制作成功。4.过表达DH转基因蚕的表型及相关基因分析利用qRT-PCR技术,首先对A4G4/UASDH个体中DH基因的时期表达特征进行分析,结果表明:DH在蛹6天和9天各有一个表达高峰,其中蛹6天峰值最高,暗示蛹6天是DH决定家蚕卵滞育与否的一个关键时期。随后对DH下游的滞育相关基因进行检测,结果显示:过表达DH对8个滞育相关基因的表达均有不同程度的影响,其中对DHR1、TRE1、TRE2、OXR1、SDH1和SDH2ab的时期表达有明显影响,对EA4和TRPA1的影响相对最小。对A4G4/UASDH的55个自交后代卵圈进行调查发现,有7个卵圈出现了滞育。该结果表明,在多化性家蚕品系中过表达DH基因,能够影响滞育相关基因的表达,但不足以使其后代蚕卵全部表现为滞育特性。5.过表达DHR1转基因蚕的表型及相关基因分析利用qRT-PCR技术,对A4G4/UASDHR1个体中DHR1基因的时期表达特征进行分析,结果显示:DHR1在蛹6天和9天各有一个表达高峰,其中蛹6天峰值最高,暗示蛹6天是DHR1参与决定家蚕卵滞育的一个关键时期。进一步对DHR1下游的滞育相关基因进行检测,结果表明:过表达DHR1对7个滞育相关基因的表达均有不同程度的影响,其中对TRE1和TRE2的影响相对较大,发生表达变化的时期主要在蛹后期和蛾期;对OXR1、SDH1、SDH2ab、EA4和TRPA1的表达影响相对较小。对A4G4/UASDHR1的59个自交后代卵圈进行调查发现,所有卵圈均未出现滞育。该结果表明,在多化性家蚕品系中过表达DHR1基因,能够影响滞育相关基因的表达,但并不能使其后代蚕卵表现为滞育特性。
[Abstract]:DH and DHR1 genes were identified and cloned from silkworm . The results showed that the DH and DHR1 genes were cloned from silkworm .
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q963

【参考文献】