坦布苏病毒FX2010株与rMM1775株的EDⅢ位点差异对其感染性影响

发布时间：2018-06-12 00:30

  本文选题：坦布苏病毒 + rFX2010-MM1775-EDⅢ　； 参考：《内蒙古农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：自鸭坦布苏病毒病2010年在中国爆发以来,给我国的养鸭业的发展带来了严重的影响。该病主要表现为产蛋鸭产蛋率严重下降,食欲下降、高热、运动障碍等临床症状,严重的还可以致鸭子死亡。2010年上海兽医研究所在当地的鸭场分离到了一株坦布苏病毒,命名为FX2010,并与早期在马来西亚地区蚊子体内分离到的MM1775株做了比较,并深入研究了该毒株的生物学特性。在复制能力、感染性和在鸭间的接触传播能力等生物特性两株病毒存在一定的差异,导致坦布苏病毒感染鸭子后所表现的不同的生物学特性,但其分子机制目前尚不清楚。E蛋白是坦布苏病毒的囊膜糖蛋白,分为3个结构域(Domain),其中,DomainⅢ的作用是介导病毒与受体蛋白的结合,与病毒的感染性密切相关。通过比对FX2010和rMM1775的氨基酸序列发现E DomainⅢ(EDⅢ)有2个氨基酸不同,分别位于E312和E332。为了探究这两个位点的差异是否导致了两株病毒感染性不同的差异。本研究使用分子克隆和PCR定点突变技术分别构建FX2010-E/V312A/T332S和MM1775-E/A312V/S332T两个E基因突变质粒,然后利用上海兽医研究所已经建立的反向遗传系统通过融合PCR技术扩增得到5'末端含有T7启动子序列的病毒全长cDNA。以上述得到的cDNA为模板,经体外转录成RNA,将此RNA再转染DF-1细胞,48小时后观察细胞是否出现特征性病变,如果有病变,当病变达到90%以上,取细胞上清液100ul,再接种DF-1细胞,72小时后细胞仍然出现特征性病变,经间接免疫荧光试验(IFA)检测有荧光,随后分段RT-PCR扩增可以获得涵盖病毒全基因组的所有特异性条带。经序列测定、比对,拯救的E基因定点突变病毒的基因序列与预望的完全一致,表明E基因定点突变病毒拯救成功,分别命名为 rFX2010-MM1775-EDⅢ和 rMM1775-FX2010-EDⅢ。进一步对rFX2010-MM1775-EDⅢ和rMM1775-FX2010-EDⅢ对鸭子的感染性进行研究。将103.5TCID50rFX2010-MM1775-EDⅢ经肌肉接种鸭子后4天,可在接种鸭子的脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、脑中检测到较高滴度的病毒,同群接触鸭在同群接触后7天、14天血清抗体均呈阳性,表明其可以接触感染同群鸭;将103.5TCID50rMM1775-FX2010-EDⅢ 经肌肉接种鸭子 4 天后,仅在肝脏、脾脏中检测到了病毒,同群接触鸭在同群接触后7天、14天血清抗体均呈阴性,其结果显示说明该毒株不能接触感染同群鸭。推断可能EDⅢ区域不是控制传播能力的主要基因或者是与某个区域共同来控制其传播能力,还需以后的实验来继续研究。
[Abstract]:Since the outbreak of duck tambusuvirus in China in 2010, it has had a serious impact on the development of duck breeding in China. The disease is characterized by a severe drop in laying rate, decreased appetite, high fever, dyskinesia and other clinical symptoms, as well as death in ducks. In 2010, the Shanghai Veterinary Research Institute isolated a Tambusuvirus strain from a local duck farm. It was named FX2010 and compared with MM1775 strain isolated from mosquitoes in Malaysia, and the biological characteristics of the strain were studied. The biological characteristics of the two viruses, such as replication ability, infectious ability and contact transmission ability between ducks, are different, which leads to different biological characteristics of Tambusuvirus infection in ducks. However, the molecular mechanism of .E protein is not clear, which is the envelope glycoprotein of Tambusuvirus, which is divided into three domains: Domainia. Domain 鈪，

本文编号：2007383