LRH-1在尼罗罗非鱼雌激素生成和卵子发生中的作用

发布时间:2018-12-16 18:57
【摘要】:肝受体同系物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1,NR5A2),隶属于核受体NR(nuclear receptor)5A亚家族,是一种重要的转录因子。LRH-1的结构在脊椎动物中十分保守。其在机体代谢、发育、胆汁酸动态平衡和类固醇生成中起着重要的作用。LRH-1在垂体、肾上腺、脂肪、胰腺、肝脏、肠道、精巢、卵巢等器官中表达。在哺乳动物中,LRH-1主要表达在各发育阶段卵巢的滤泡颗粒细胞(Granulosa cells)和黄体细胞中,在鞘膜细胞(Theca cells)中没有表达;在精巢生殖细胞和莱氏细胞(Leydig cells)中有表达,在支持细胞(Sertoli cells)中没有表达。在小鼠中,LRH-1纯合敲除致死。杂合突变雄鼠的附睾和精囊体重比正常小鼠低,Star、Scc、3β-HSD等类固醇生成因子表达含量下降;杂合突变LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等类固醇基因表达水平降低而导致小鼠不能排卵。颗粒细胞特异性条件敲除LRH-1雌鼠不育,不能排卵。在硬骨鱼类中,利用RT-PCR的方法证实了LRH-1在脑、垂体、鳃丝、鳔、肝脏、肠道、脂肪、血液、卵巢以及肾脏和头肾中均有表达。在石斑鱼中,LRH-1表达在卵巢的滤泡细胞和生殖细胞中。有体外实验证明LRH-1可以结合在cyp19a1a和cyp19a1b的启动子上并激活它们的表达。在脊椎动物中,至今没有LRH-1在小鼠以外的功能研究报道,也没有对罗非鱼LRH-1的表达和功能进行系统的研究报道。在本研究中,利用RT-PCR,Western blot以及免疫组织化学方法研究了LRH-1在罗非鱼不同组织和雌雄性腺不同发育阶段中的表达以及细胞定位;并利用CRISPR/Cas9系统对尼罗罗非鱼中的LRH-1进行突变,获得了F0代阳性鱼和F1代杂合子,进一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究结果如下:通过中山大学张为民教授实验室获得斑点石斑鱼LRH-1抗体,利用ClustalX软件对用于制作石斑鱼LRH-1多克隆抗体的抗原氨基酸序列(172-288)和罗非鱼的LRH-1相应蛋白氨基酸序列进行比对,发现石斑鱼抗原部分98%的氨基酸序列都可以比对到罗非鱼的蛋白氨基酸序列上。证明石斑鱼的LRH-1抗体可以用来检测罗非鱼的LRH-1蛋白。我们通过Western blot结果显示:石斑鱼的LRH-1多克隆抗体能特异识别罗非鱼的LRH-1天然蛋白(85 kDa),并发现LRH-1在罗非鱼的精巢、卵巢中均有一条主带,且在心脏、脑、肝脏中表达。RT-PCR结果显示LRH-1可在罗非鱼脑、鳃丝、心脏、脾、肝脏、肠、卵巢、精巢、肌肉等组织中表达。此外,免疫组化结果显示:LRH-1主要表达在早期生殖细胞和类固醇生成细胞,在卵巢中表达于卵原细胞、卵母细胞、间质细胞和鞘膜细胞,在精巢中表达于精原细胞、精母细胞和莱氏细胞。且LRH-1与Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表达于卵巢的间质细胞和鞘膜细胞。LRH-1和Sf-1表达模式基本一致。利用CRISPR/Cas9技术在尼罗罗非鱼突变LRH-1基因,获得F0代XX与XY的阳性鱼,尾鳍突变率最高为98%,最低为50%。对F0代阳性鱼分析表明:与对照XX雌鱼相比,120 dah时,XX阳性鱼卵巢出现空腔,且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表达下调。同时,通过EIA检测显示,XX阳性鱼雌激素水平下调;210dah时,XX阳性鱼卵巢相比对照组卵巢表现为发育延迟,卵巢中还保留大量类固醇阳性细胞。通过LRH-1突变的阳性F0代XY雄鱼与野生型XX雌鱼杂交产生F1代杂合子LRH-1+/-。性腺组织检测结果表明,与对照雌鱼相比,在90 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中,间质细胞减少,Cyp19a1a/cyp19a1a表达下调,雌激素水平下调。在210 dah LRH-1+/-XX雌鱼卵巢中,卵子发育延迟,有大量卵母细胞停留在I、II时相,迟迟不能积累卵黄,且有空腔出现,卵巢性腺成熟系数(GSI)显著降低;与对照XY雄鱼相比,90 dah时,LRH-1+/-XY雄鱼精巢内部结构紊乱,但在180 dah时精巢内部恢复正常,产生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表达下调,雌激素水平下调,雄激素水平没有显著变化。由于F1代雌鱼不育,所以尝试用两种方法建立LRH-1纯合突变鱼,第一种方法为用F0代LRH-1突变雌鱼和F0代突变雄鱼杂交,尝试在杂交后代中筛选纯合子;第二种方法为用F0代突变雌鱼和F1代突变雄鱼杂交,尝试在杂交后代中筛选纯合子,但酶切结果显示杂交后代均为杂合子和野生型,没有发现纯合子,表明纯合突变致死。综上所述,本研究结果证实在罗非鱼性腺中LRH-1的表达模式与哺乳动物基本一致:在生殖细胞和类固醇生成细胞中表达。并且在硬骨鱼类雌激素生成和卵子生成中具有重要作用。这反映出LRH-1在脊椎动物中的表达和功能具有保守性。
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【学位授予单位】:西南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:Q953

【参考文献】

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本文编号:2382881

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