【摘要】：一、研究目的及背景肌球蛋白(Myosin)家族属于马达蛋白超家族,可以将细胞内的机械能转化为化学能,进而参与生物体内一系列生理生化反应。目前已发现超过20种肌球蛋白分子,在结构和功能上具有差异,但都可以通过头部结合ATP酶水解ATP沿actin进行移动。目前研究最多是Myosin Ⅱ,即肌球蛋白Ⅱ。Myosin Ⅱ最早在肌肉中被发现,通过水解ATP产生的能量介导肌肉收缩。随着研究的深入,发现在非肌肉组织,如神经元中也存在Myosin Ⅱ的表达,称为非肌肉型MyosinⅡ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)。Myosin Ⅱ 是一个六聚体,包含一对高分子量的重链(MHC)及结合在重链颈部的两对小分子量的轻链(MLC),其中包含两条调节型轻链和两条必要型轻链。中枢神经系统中Myosin Ⅱ有较高的表达,并起着重要的调控作用,主要参与神经元的迁移、突起的生长及导向、微管在神经元生长锥内的状态与转运、肌动蛋白(actin)的动态变化、树突棘spines的形成等过程。NMⅡ的活性主要受其轻链MLC2的激活调控,参与的激酶主要有肌球蛋白轻链激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)及Rho亚家族(RhoA)激酶。NMⅡ作为细胞内基础的马达蛋白也参与到脑的高级功能中。文献报道Myosin Ⅱ在早期长时程增强(Long Term Potentiation,LTP)的维持过程发挥作用;并且通过不同信号激活,分别参与到长时程条件性恐惧记忆的整合阶段,及缘下回(infralimbic cortex,IL)脑区味觉厌恶记忆的消退中。目前的报道多以直接干扰重链的形成从而影响Myosin Ⅱ功能为主,但是Myosin Ⅱ活性上游受到哪些因素调控,并没有详细的报道。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是脑中广泛存在的神经营养因子,通过与膜上两种不同亲和力的受体-高亲和力酪氨酸激酶受体B(Tropomyosin receptor kinase B,Trk)和低亲和力神经营养因子受体(The Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor,P75NTR)结合,激活下游信号通路。BDNF除了能够促进神经元的存活及分化、突起的生长,还在突触可塑性的调节中发挥重要功能。突触的可塑性也被广泛认为是学习记忆的分子基础,调控神经元之间的信息传递。在体外培养的海马神经元中,BDNF能够诱导LTP的产生并维持LTP的稳定。BDNF还可以通过调控肌动蛋白(actin)的动态变化促进树突棘的形成。BDNF是否对Myosin II的活性存在调控作用,具体的信号通路又是什么?本文采用分子生物学及细胞生物学的多种方法,证实BDNF/TrkB信号通路可以上调调节型轻链MLC2的磷酸化水平,从而上调Myosin II活性。进一步证明这一过程并不依赖TrkB下游经典的三条信号通路,而是通过SRC家族的LYN激酶实现的。本研究可更好的帮助我们了解Myosin II的功能及作用机制。二、实验方法1、构建各种小干扰片段。2、特异性MLCK短肽3、海马神经元的培养及其转染。4、Western Bolt 及 CO-IP三、实验结果1、BDNF通过高亲和性受体TrkB调节MLC2磷酸化。首先通过蛋白免疫印迹的方法发现,给予体外培养的海马神经元BDNF刺激30min时,p-MLC2灰度值较con组明显增加(p0.05,而且随时间增加(2h时)灰度值持续增加(p≤0.01)。在给予BDNF刺激前加入抑制P75NTR功能的短肽(TAT-Pep5)、Trk激酶抑制剂(K252a)预处理30min,与对照组相比较,K252a+BDNF组p-MLC2灰度值并无明显增加。同样的给予老鼠海马脑区注射BDNF、K252a结果发现,BDNF组p-MLC2明显增加(p0.05)。2、BDNF通过激活MLCK调控MLC2磷酸化我们发现分别给予体外培养的海马神经元磷酸酶抑制剂(CalA)、ROCK激酶抑制剂(Y27623)、MLCK激酶抑制剂(ML-7)预处理30min后,BDNF刺激2h,ML-7+BDNF组p-MLC2没有明显升高。在体外培养的海马神经元中加入特异性短肽抑制MLCK与MLC2结合后,BDNF刺激2h,TAT MLCK+BDNF组p-MLC2并无明显变化。3、SRC通路参与BDNF调控MLC2磷酸化水平变化之前发现BDNF对p-MLC2的调控依赖TrkB的激活,我们分别给予体外培养的海马神经元TrkB下游三条经典信号通路抑制剂U0126(MAPK信号通路抑制剂),U73122(PLCγ信号通路抑制剂),LY294002(PI3K信号通路抑制剂)30min预处理后,BDNF 刺激 2h,与 BDNF 组相比较,U0126+BDNF、U73122+BDNF、LY294002+BDNF组p-MLC2灰度值无明显变化(p0.05),这提示我们BDNF对p-MLC2的调控不是通过三条经典信号通路发挥作用。接下来给予TrkB下游SRC信号通路抑制剂PP1 30min后,BDNF刺激2h,与BDNF组相比较,PP1+BDNF组p-MLC2灰度值显著降低(p≤0.05)。分别干扰SRC家族成员,发现干扰掉LYN激酶后加BDNF刺激时p-MLC2无明显升高。4、LYN作为上游蛋白调节MLCK磷酸化水平我们通过免疫共沉淀的方法,检测LYN-Myc与MLCK-HA是否存在结合,结果发现LYN与MLCK存在相互作用。接下来干扰掉LYN的表达,BDNF刺激2h,p-MLCK的灰度值显著下降(p0.05),同时过表达LYN后p-MLCK显著增加(p0.05)。结论:通过一系列的细胞及分子生物相关实验,我们证明了 BDNF通过激活SRC信号通路上调MLCK磷酸化水平从而增加MLC2的磷酸化水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q42
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