【摘要】：原生动物纤毛虫细胞结构高度特化,是最复杂的单细胞生物。纤毛虫皮层结构复杂,胞质内具有多种细胞器,各胞器协同作用完成多种生命活动。纤毛虫射出胞器具有防御、捕食、胞间交流等重要功能,而且其对原生动物系统学以及分类学提供了参考依据,因此纤毛虫射出胞器一直是国内外学者的关注。目前,对于模式生物——四膜虫及草履虫的射出胞器研究已经十分深入,而对于高等腹毛目纤毛虫研究较少,且仅有形态学水平的报道,对于其组成成分及其功能未有涉及。本文通过微分干涉相差显微术、扫描电镜术、透射电镜术对长颗粒尖毛虫(Oxytricha longigranulosa)射出胞器的结构进行研究,通过甲基绿-派洛宁染色法、阿尔新兰染色法、扫描电镜术以及高效液相色谱-串联质谱法对颗粒尖毛虫(Oxytricha granulifera)射出胞器的蛋白质组成成分进行更加深入的探讨。主要结果如下:1长颗粒尖毛虫形态观察及射出胞器的研究长颗粒尖毛虫细胞呈细长条形,背腹扁平,长80-110 μm,宽30-50 μm,是具有典型的"8-5-5"腹面纤毛模式的尖毛虫,其左、右缘棘毛各1列。光镜下可见其表膜下存在无色的圆形颗粒状结构,直径约0.5 μm。背面观显示,相邻两列背触毛之间球形颗粒排成3-5列长列,并随身体弯曲发生弯曲;腹面观显示,球形颗粒在腹棘毛周围相对分布较少,其多分布于细胞的头部、尾部,以及左右缘棘毛附近。本文首次从超微结构对长颗粒尖毛虫形态及射出胞器的分布进行了详细描述。扫描电镜观察发现,长颗粒尖毛虫射出胞器位于表膜下,背面多呈长列或者短列状分布,且在背触毛周围稍有聚集;腹面分布与背面有明显的差异,腹面射出胞器多聚集分布在口围带附近,横棘毛下方可见射出胞器3-4排呈"弧形"排列;右缘棘毛左侧2-3列射出胞器纵贯体长;左缘棘毛右侧2-3射出胞器始于腹面中部一直延伸至尾部。分泌出体外的射出胞器竖直或斜向分布在体表,呈"梭型",长约1μm,顶部为直径约0.5μm,凹陷小窝,尾部稍尖。将细胞剖开,清晰可见表膜下整齐排列的成熟射出胞器。透射电镜观察显示,成熟的射出胞器为外被薄膜的椭圆形结构,长度约1μm,宽度约为0.5 μm,与扫描电镜下观察一致。顶部有低电子密度的凹陷小窝,体部电子密度高且均一。长颗粒尖毛虫无色皮层颗粒与射出胞器在胞器分布、形态结构等方面具有高度一致性,在受到刺激时可分泌出体外,因此认为其无色皮层颗粒就是一种射出胞器。这种射出胞器和黏液泡、毒素泡在结构和发射机制上具有较大差异,而与颗粒尖毛虫、印度原毛虫射出胞器在定位、结构、组成方面具有高度一致性,因此作者认为此射出胞器为"分泌型"射出胞器,并且通过比较尖毛虫科其他具有无色皮层颗粒的种类,推测所有尖毛虫科的无色皮层颗粒都是此类射出胞器。2颗粒尖毛虫射出胞器的蛋白质成分分析本文通过反复实验发现,低浓度基绿-派洛宁溶液刺激颗粒尖毛虫细胞后,射出胞器在细胞表面形成一层"壳"状结构,而颗粒尖毛虫则通过不断的收缩运动从"壳"中脱离。利用离心法可对射出结构形成的"壳"进行浓缩收集。将聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)所得的特异性条带进行高效液相色谱-串联质谱分析(LC-MS/MS),检索Oxytricha trifallax蛋白数据库,对比质谱鉴定结果的筛选标准与蛋白质可信度判断标准,结果显示:射出胞器中有4种高可信蛋白以及21种可信蛋白;在25种蛋白质中有8种已知蛋白质和17种未知蛋白质。8种已知蛋白分别为:S5核糖体蛋白(Ribosomal protein S5)、β-微管蛋白(Tubulin beta chain)、脒基转移酶(Amidinotransferase)、含蛋白激酶蛋白(Protein kinasedomain containing protein)、PAS 结构域的蛋白家族(PAS domain S-box family protein)、胸苷激酶(Thymidine kinase)、PP2C、钙调蛋白钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase)。除此之外,还有多种具有高可信度的未知蛋白质,猜测这些蛋白质与射出胞器形成与射出有密切联系。本文研究的尖毛虫射出胞器蛋白质组成与其他常见种类射出胞器差异较大。四膜虫黏液泡的主要成分为高分子量的粘多糖、天冬氨酸蛋白酶、Cth4p等,四膜虫黏液泡所含成分在颗粒尖毛虫均未见报道;颗粒尖毛虫细胞所测得蛋白质种类更丰富,但未发现与黏液泡蛋白相关成分。相比于刺丝泡、毒素泡内含有毒物质,本文研究中也没有发现与毒素类物质相关的蛋白质,因而认为本报道的蛋白质为尖毛虫科射出胞器所特有的蛋白质组成,这种射出胞器在射出机制、功能方面与低等纤毛虫射出胞器存在差异。钙调蛋白依赖性蛋白激酶可能与钙联蛋白和Ca2+相互作用,推测可能有利于射出胞器在受外界刺激时分泌出体外;S5核糖体蛋白或对温度刺激射出胞器分泌出体外有重要促进作用;脒基转移酶则可能通过对磷酸和磷酸肌酸的作用,促进ATP的合成,为射出胞器分泌出体外提供能量支持。除此之外,还有多种具有高可信度的未知蛋白质,这些蛋白质的功能则有待进一步研究。本文对长颗粒尖毛虫及其射出胞器形态、分布等情况做了详细的描述,并对射出胞器与表膜下微管带的动态关系进行了深入分析,为尖毛虫科射出胞器的相关研究丰富了资料。文章中首次就获得大量射出胞器的方法进行了详细描述,并且首次对射出物的蛋白质组成进行了初步探讨。此研究为认识射出胞器的组成提供了新的研究思路,并对进一步阐明原生动物细胞的结构、形成、进化、功能以及细胞调控等提供了基础资料。
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【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q954
【参考文献】
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