疏绵状嗜热丝孢菌中CAP的敲除、互补及功能研究

发布时间：2020-01-17 17:39

【摘要】：疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种与人类的日常生活密切相关且分布广泛的嗜热真菌,在真核生物中生长上限温度是最高的。目前,从该菌中已分离得到了多种嗜热酶,真核表达后广泛应用于工、农业生产和微生物研究中,使得该菌在医药、酿造业、发酵业、废物处理等多个领域中的影响越来越大。因而,近年来科研工作者的研究主要集中在热稳定的蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、几丁质分解酶及木聚糖酶等嗜热酶基因的克隆及其生理生化性质方面,而对于该菌株特定基因遗传功能的研究至今少有报道。对于丝状真菌而言,在稻瘟病菌中CAP基因缺失后,会影响细胞的活力及附着胞的形成进而降低致病能力。通过序列比对发现,在疏绵状嗜热丝孢菌中也存在CAP同源基因,且与稻瘟病菌中的CAP1基因的同源性为42.75%。通过生物信息学分析可知,CAP属于CAP_C超家族中的成员,亚细胞定位预测定位于细胞膜上,含有CARP结构域且高度保守。NJ法建立系统发育树,分析亲缘关系可知:与曲霉菌(Aspergillus lentulus)的进化距离最近,其与人类(Homo sapiens)、小家鼠(Mus musculus)的进化距离最远。为了进一步探知CAP的功能,我们通过构建CAP基因的敲除载体及互补/亚细胞定位载体,进而采用ATMT法转化疏绵状嗜热丝孢菌的分生孢子获得了CAP基因的敲除突变株△CAP;然后,以十字花科炭疽病菌中的CAP(CH07570-△CAP,CH14404-△CAP)/稻瘟病菌中的CAP(MGG01722.6-△CAP)基因为互补序列,通过PEG介导的遗传转化疏绵状嗜热丝孢菌原生质体,得到了互补/亚细胞定位突变株△CAP/CAP。以野生型菌株9w-WT及上述突变株为研究材料,结果发现:△CAP营养生长比9w-WT稍快;△CAP与9w-WT气生菌丝类似。进行孢子振荡培养试验,观察上述菌株的孢子形态发现,振荡培养后的9w-WT孢子呈表面光滑中空的大小较均一的圆球体,而敲除菌株△CAP则呈两头尖的刺状不规则球体,互补菌株CH07570-△CAP、CH14404-△CAP呈现大小差异较大的中空的圆球体,互补菌株MGG01722.6-△CAP呈辐射状表面粗糙的不规则圆球体。这一生物学特征可能与CAP参与细胞表面识别有关。因此,CAP对于维持疏绵状嗜热丝孢菌的营养生长是必不可少的。产孢量统计可知,9w-WT的孢子量是△CAP的2倍多;进一步测定孢子萌发萌发率发现,△CAP的孢子萌发率与9w-WT相比没有明显差异,且互补菌株孢子萌发率在一定程度上野生型菌株孢子萌发率相当。因而,CAP不影响疏绵状嗜热丝孢菌的孢子萌发活力。我们还做了相关逆境胁迫试验,1、H2O2胁迫试验:与野生型相比,敲除菌株△CAP对H2O2敏感性降低。与各菌株在PDA培养基上的菌落形态类似,出现了菌落颜色的变化,这与上述菌株的产孢情况相对应。2、细胞壁完整性试验:相对于野生型菌株和互补菌株,△CAP菌株对Congo-Red及SDS不敏感,由此可见,CAP基因与疏绵状菌细胞壁的完整性有关,且CAP的表达是对外界环境中基础逆境的响应。3、渗透胁迫试验:相对于野生型菌株,敲除菌株对渗透压影响因子更加敏感,抑制疏绵状嗜热丝孢菌的生长,而互补菌株则不同程度地恢复了菌株的渗透抗逆反应。综上表明,CAP对于维持疏绵状嗜热丝孢菌的生长发育过程以及逆境应答响应是必不可少的。为了探究外源加入c AMP对上述敲除菌株及互补菌株的影响,在CM及PDA培养基中加入c AMP,结果发现,上述菌落颜色均呈现棕黄色且渗透至培养基中,这可能与代谢物质的产生及产孢量有关;此外还发现,外源加入c AMP能有效弥补CAP缺失对疏绵状嗜热丝孢菌生长发育造成的不良影响,产孢量得到部分或完全恢复。本文是以稻瘟病菌中一个与致病性相关的CAP1基因为出发点,通过序列比对,发现疏绵状嗜热丝孢菌中也有CAP基因,本研究经过一系列的生物信息学分析,并通过基础试验获得了敲除及互补/亚细胞定位菌株,进而进行CAP功能的研究。这为以后研究疏绵状嗜热丝孢菌及其它嗜热真菌特定基因的蛋白家族提供了一定的理论基础和方法指导;也为嗜热真菌相关基因的遗传功能的研究打开了新的视角,以期能够尽早探知嗜热真菌的嗜热机制。
【图文】：

图 1.1 CAP 蛋白结构(图片来自 Ksiazek et al.,2003)1 The protein structure ofAdenylate cyclase-associated protein（酸环化酶结合蛋白（CAP）的功能概述

1.2 cAMP 信号传递系统（图片来自申s诺，

本文编号：2570694